أساس التصميم التمهيدي (يمكن حل 99٪ مشكلة)
1. طول التمهيدي: يتطلب الكتاب المدرسي 15-30 نقطة أساس ، عادة حوالي 20 نقطة أساس.من الأفضل أن تكون الحالة الفعلية 18-24 نقطة أساس لضمان الخصوصية ، ولكن كلما كان التمهيدي أفضل ، فإن التمهيدي الطويل جدًا سيقلل أيضًا من الخصوصية ويقلل العائد.
2. مدى تضخيم التمهيدي: 200-500bp مناسب ، ويمكن توسيع الجزء إلى 10kb في ظل ظروف محددة.
3. قاعدة التمهيدي: يجب أن يكون محتوى G + C 40-60٪ ، القليل جدًا من تأثير تضخيم G + C ليس جيدًا ، والكثير من G + C يسهل ظهور نطاقات غير محددة.من الأفضل توزيع ATGC بشكل عشوائي ، مع تجنب المجموعات المكونة من أكثر من 5 نيوكليوتيدات البيورين أو بيريميدين.Multi-gc للتسلسل 5 والمتواليات المتوسطة لزيادة الاستقرار ، وتجنب GC الغني في النهاية 3 ، أو عدم وجود GC للقواعد الثلاثة الأخيرة ، أو عدم وجود GC لـ 3 من القواعد الخمس الأخيرة.
4. تجنب البنية الثانوية في البادئات ، وتجنب التكامل بين اثنين من البادئات ، وخاصة التكملة في النهاية 3 ، وإلا سيتم تشكيل ثنائي التمهيدي وسيتم إنشاء نطاقات مضخمة غير محددة.
5. يجب إقران القواعد الموجودة في الطرف 3 من البادئات ، وخاصة القواعد الأخيرة وقبل الأخيرة ، بشكل صارم لتجنب فشل PCR بسبب القواعد الطرفية غير المزدوجة.
6. تحتوي البادئات أو يمكن إضافتها مع مواقع الانقسام المناسبة ، ويفضل أن يكون للتسلسل المستهدف المكبر مواقع انقسام مناسبة ، وهو أمر مفيد للغاية لتحليل الانقسام أو الاستنساخ الجزيئي.
7. خصوصية البادئات: يجب ألا تحتوي البادئات على تماثل واضح مع المتواليات الأخرى في قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي.
8. تعلم استخدام البرامج: PP5 ، Oligo6 ، DNAstar ، Vector NTI ، primer3 (هذا التصميم عبر الإنترنت يعمل بشكل أفضل).
المحتوى أعلاه يمكن أن يحل ما لا يقل عن 99٪ من مشاكل التصميم التمهيدي.
التحكم في تفاصيل التصميم التمهيدي
1. طول التمهيدي
طول التمهيدي العام هو 18 ~ 30 قاعدة.بشكل عام ، فإن العامل الأكثر أهمية في تحديد درجة حرارة التلدين للبرايمر هو طول التمهيدي.يتم تحديد درجة حرارة التلدين للطلاء التمهيدي بشكل عام (قيمة Tm -5 ℃) ، وبعضها يستخدم قيمة Tm مباشرة.يمكن استخدام الصيغ التالية لحساب درجة حرارة التلدين تقريبًا.
عندما يكون طول البرايمر أقل من 20 نقطة أساس: [4 (G + C) +2 (A + T)] - 5 ℃
عندما يكون طول البرايمر أكبر من 20 نقطة أساس: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (٪ GC) -500 / طول -5 ℃
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا استخدام العديد من البرامج لحساب درجة حرارة التلدين ، وسيكون مبدأ الحساب مختلفًا ، لذلك في بعض الأحيان قد يكون للقيمة المحسوبة فجوة صغيرة.لتحسين تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم استخدام أقصر البادئات التي تضمن درجات حرارة صلبة لا تقل عن 54 درجة مئوية للحصول على أفضل كفاءة وخصوصية.
بشكل عام ، تزداد خصوصية البرايمر بعامل أربعة لكل نيوكليوتيد إضافي ، بحيث يكون الحد الأدنى لطول التمهيدي لمعظم التطبيقات هو 18 نيوكليوتيد.الحد الأعلى لطول التمهيدي ليس مهمًا جدًا ، ويرتبط بشكل أساسي بكفاءة التفاعل.بسبب الانتروبيا ، كلما طالت فترة التمهيدي ، انخفض معدل التصلب للارتباط بالحمض النووي المستهدف لتشكيل قالب مستقر مزدوج الشريطة لربط بوليميراز الحمض النووي.
عند استخدام برنامج لتصميم الاشعال ، يمكن تحديد طول الاشعال بواسطة قيمة TM بدوره ، خاصة بالنسبة للاشعال PCR الكمي مضان ، يجب التحكم في TM = 60 ℃ أو نحو ذلك.
2.GC المحتوى
بشكل عام ، محتوى G + C في تسلسل التمهيدي هو 40٪ ~ 60٪ ، ويجب تنسيق محتوى GC وقيمة Tm لزوج من البادئات.إذا كان التمهيدي لديه اتجاه GC أو AT خطير ، فيمكن إضافة كمية مناسبة من ذيل A أو T أو G و C إلى نهاية 5 'من التمهيدي.
3. تلدين درجة الحرارة
يجب أن تكون درجة حرارة التلدين أقل بـ 5 ℃ من درجة حرارة unchain.إذا كان عدد القواعد الأولية صغيرًا ، فيمكن زيادة درجة حرارة التلدين بشكل مناسب ، مما قد يزيد من خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل.إذا كان عدد القواعد كبيرًا ، يمكن تقليل درجة حرارة التلدين بشكل مناسب.لن يؤثر اختلاف درجة حرارة التلدين بين زوج من البادئات 4 ℃ ~ 6 على محصول PCR ، ولكن من الناحية المثالية ، فإن درجة حرارة التلدين لزوج من البادئات هي نفسها ، والتي يمكن أن تختلف بين 55 ~ 75.
4. تجنب منطقة البنية الثانوية لقالب التضخيم
من الأفضل تجنب منطقة البنية الثانوية للقالب عند اختيار الجزء المضخم.يمكن التنبؤ بالهيكل الثانوي المستقر للجزء المستهدف وتقديره بواسطة برامج الكمبيوتر ذات الصلة ، وهو أمر مفيد في اختيار القالب.تظهر النتائج التجريبية أن التوسع غالبًا ما يكون غير ناجح عندما تكون الطاقة الحرة (△ G) للمنطقة المراد توسيعها أقل من 58.6lkJ / mol.
5. عدم تطابق الحمض النووي الهدف
عندما يكون تسلسل الحمض النووي المستهدف كبيرًا ، قد يرتبط التمهيدي بأجزاء متعددة من الحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى ظهور نطاقات متعددة في النتيجة.هذه المرة من الضروري استخدام اختبار برنامج BLAST والموقع الإلكتروني:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.حدد محاذاة تسلسلين (bl2seq).
إن لصق تسلسلات التمهيدي في المنطقة 1 وتسلسل الحمض النووي المستهدف في المنطقة 2 أمر قابل للتبادل ، ويحسب BLAST الاحتمالات التكميلية والمضادة للمعنى والإمكانيات الأخرى ، لذلك لا يحتاج المستخدمون إلى ملاحظة ما إذا كانت كلتا السلاسل عبارة عن سلاسل إحساس.يمكنك أيضًا إدخال رقم GI إذا كنت تعرف رقم GI للتسلسل في قاعدة البيانات ، لذلك لن تضطر إلى لصق جزء كبير من التسلسل.أخيرًا ، انقر فوق Align at 3 لمعرفة ما إذا كان التمهيدي يحتوي على مواقع متجانسة متعددة في الحمض النووي المستهدف.
6. محطة التمهيدي
الطرف 3 'من التمهيدي هو المكان الذي يبدأ منه الامتداد ، لذلك من المهم منع عدم التطابق من البدء من هناك.يجب ألا تكون نهاية 3 'أكثر من 3 G أو C متتالية ، لأن هذا سيؤدي إلى تشغيل التمهيدي عن طريق الخطأ في منطقة تسلسل التخصيب G + C.لا يمكن أن تشكل النهاية 3 أي بنية ثانوية ، باستثناء تفاعلات PCR (AS-PCR) الخاصة ، لا يمكن أن تكون نهاية 3 من التمهيدي غير متطابقة.على سبيل المثال ، إذا تم تضخيم منطقة التشفير ، فلا ينبغي إنهاء الطرف الثالث من التمهيدي في الموضع الثالث من الكودون ، لأن الموضع الثالث من الكودون يكون عرضة للتدهور ، مما سيؤثر على خصوصية وكفاءة التضخيم.عند استخدام بادئات التضمين ، ارجع إلى جدول استخدام الكودون ، وانتبه إلى التفضيل البيولوجي ، ولا تستخدم بادئات التضمين في نهاية 3 ، واستخدم تركيزًا أعلى من البادئات (1uM-3uM).
7. الهيكل الثانوي للاشعال
لا ينبغي أن تحتوي البادئات نفسها على تسلسلات تكميلية ، وإلا فإن البادئات نفسها سوف تنثني في هياكل دبوس الشعر ، وسيؤثر هذا الهيكل الثانوي على ربط البادئات والقوالب بسبب العائق الفاصل.إذا تم استخدام الحكم الاصطناعي ، فيجب ألا تكون القواعد التكميلية المستمرة للبادئات نفسها أكبر من 3 نقاط أساس.يجب ألا يكون هناك تكامل بين البادئين ، خاصةً يجب تجنب التداخل التكميلي للنهاية 3 لمنع تكوين ثنائيات التمهيدي.بشكل عام ، يجب ألا يكون هناك أكثر من 4 قواعد تماثل متتالية أو تكامل بين زوج من البادئات.
8. إضافة علامات أو مواقع
نهاية 5 'لها تأثير ضئيل على خصوصية التضخيم وبالتالي يمكن تعديلها دون التأثير على خصوصية التضخيم.تضمن تعديل نهاية التمهيدي 5 ': إضافة موقع تقييد الإنزيم ؛البيوتين المسمى ، التألق ، الديجوكسين ، Eu3 + ، إلخ. إدخال تسلسل الحمض النووي المرتبط بالبروتين ؛إدخال مواقع الطفرات ، وإدخال متواليات الطفرات وفقدانها وإدخال تسلسلات المحفز ، إلخ. ستؤثر القواعد الإضافية بشكل أو بآخر على كفاءة التضخيم وتزيد من فرصة تكوين ثنائي التمهيدي ، ولكن يجب تقديم بعض التنازلات للخطوة التالية.يمكن إضافة التسلسلات الإضافية غير الموجودة في التسلسل المستهدف ، مثل مواقع التقييد وتسلسلات المحفز ، إلى نهاية 5 من التمهيدي دون التأثير على الخصوصية.لم يتم تضمين هذه التسلسلات في حساب قيم التمهيدي Tm ، ولكن يجب اختبارها من أجل التكامل والبنية الثانوية الداخلية.
9. Subclones
في معظم الأحيان ، يكون PCR عبارة عن استنساخ أولي فقط ، ومن ثم نحتاج إلى استنساخ جزء الهدف إلى نواقل مختلفة ، لذلك نحتاج إلى تصميم قواعد إضافية للعملية التالية في خطوة PCR.
نلخص أدناه بعض التسلسلات المصممة للاستنساخ الفرعي.
تمت إضافة موقع تقييد نوكلياز داخلي
تعد إضافة مواقع تقييد الإنزيم الطريقة الأكثر شيوعًا لاستنساخ منتجات PCR.بشكل عام ، موقع الانقسام هو ستة قواعد ، بالإضافة إلى الطرف 5 'من موقع الانقسام يحتاج إلى إضافة 2 ~ 3 قواعد واقية.ومع ذلك ، فإن عدد القواعد الوقائية التي تتطلبها الإنزيمات المختلفة مختلف.على سبيل المثال ، لا يتطلب SalⅠ أي قاعدة واقية ، يتطلب EcoRⅤ قاعدة واقية واحدة ، يتطلب NotⅠ قاعدتين وقائيتين ، و Hind Ⅲ يتطلب 3 قواعد وقائية.
يضيف LIC الذيل
الاسم الكامل لـ LIC هو الاستنساخ المستقل عن الارتباط ، وهي طريقة استنساخ اخترعتها Navogen خصيصًا لجزءها من ناقل pET.يحتوي ناقل PET المحضّر بطريقة LIC على نهايات لاصقة غير مكملة من 12 إلى 15 قاعدة مفردة ، والتي تكمل الأطراف اللاصقة المقابلة على جزء إدراج الهدف.لأغراض التضخيم ، يجب أن يكمل التسلسل التمهيدي 5 للجزء المُدرج متجه LIC.يمكن أن يشكل النشاط الخارجي 3 → 5 لبوليميراز الحمض النووي T4 طرفًا لزجًا واحدًا على الجزء المُدرج بعد وقت قصير.نظرًا لأن المنتج لا يمكن تشكيله إلا من التلدين المتبادل لجزء الإدخال المُجهز والمتجه ، فإن هذه الطريقة سريعة وفعالة للغاية ، ويتم توجيهها للاستنساخ.
إخراج TA استنساخ إضافة الذيل
لم يكن استنساخ TA قادرًا على استهداف الجزء في ناقل ، لذلك قدم Invitrogen لاحقًا ناقلًا يمكن أن يستهدف الاستنساخ ، والذي يحتوي على أربعة قواعد GTGGS بارزة في نهاية واحدة.لذلك ، في تصميم بادئات PCR ، يجب إضافة التسلسلات التكميلية وفقًا لذلك ، بحيث يمكن "توجيه" الأجزاء.
إذا كان لديك وقت قصير ، فيمكنك تجربة التركيب المباشر ، والجمع بين الجين والناقل ، وهو ما نسميه التوليف الجيني ET في علماء الموسيقى.
طريقة الاستنساخ In-Fusion
لا حاجة ليجاز ، لا حاجة لرد فعل طويل.طالما تم إدخال تسلسل على طرفي المتجه الخطي في تصميم البادئات ، ثم يتم إضافة منتج PCR والمتجه الخطي إلى محلول إنزيم الاندماج الذي يحتوي على BSA ويوضعان في درجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة ، يمكن إجراء التحويل.هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لتحويل الحجم الكبير.
10. دمج التمهيدي
في بعض الأحيان ، لا يُعرف سوى معلومات تسلسل محدودة عن تصميم التمهيدي.على سبيل المثال ، إذا كان تسلسل الأحماض الأمينية معروفًا فقط ، فيمكن تصميم أساس الدمج.التمهيدي الاندماجي هو مزيج من التسلسلات المختلفة التي تمثل جميع الاحتمالات الأساسية المختلفة التي تشفر حمض أميني واحد.لزيادة الخصوصية ، يمكنك الرجوع إلى جدول استخدام الكودون لتقليل الضم وفقًا لتفضيلات الاستخدام الأساسي للكائنات المختلفة.يمكن إقران Hypoxanthine مع جميع القواعد لتقليل درجة حرارة التلدين للبرايمر.لا تستخدم القواعد المرفقة في الطرف 3 من التمهيدي لأن تلدين القواعد الثلاثة الأخيرة في الطرف 3 يكفي لبدء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الموقع الخطأ.يتم استخدام تركيزات أعلى من التمهيدي (1 ميكرومتر إلى 3 ميكرومتر) لأن البادئات في العديد من مخاليط الضم ليست خاصة بالقالب المستهدف.
المواد الخام PCRيتحكم
1. كمية التمهيدي
تركيز كل أساس هو 0.1 ~ 1 ميومول أو 10 ~ 100 ميكرولتر.من الأفضل الحصول على النتيجة المطلوبة بأقل كمية من البرايمر.سيؤدي التركيز العالي من البرايمر إلى عدم تطابق وتضخيم غير محدد ، ويزيد من فرصة تكوين ثنائيات بين البادئات.
2. تركيز التمهيدي
تركيز البرايمر يؤثر على الخصوصية.يتراوح تركيز التمهيدي الأمثل بشكل عام بين 0.1 و 0.5 ميكرومتر.تؤدي التركيزات العالية من البرايمر إلى تضخيم منتجات غير محددة.
3. تلدين درجة حرارة التمهيدي
معلمة مهمة أخرى للاشعال هي درجة حرارة الانصهار (Tm).هذه هي درجة الحرارة عندما يتم تمثيل 50٪ من البادئات والتسلسلات التكميلية كجزيئات DNA مزدوجة الشريطة.مطلوب Tm لضبط درجة حرارة التلدين PCR.من الناحية المثالية ، تكون درجة حرارة التلدين منخفضة بدرجة كافية لضمان التلدين الفعال للبادئات بالتسلسل المستهدف ، ولكنها عالية بما يكفي لتقليل الارتباط غير المحدد.درجة حرارة التلدين المعقولة من 55 إلى 70.يتم ضبط درجة حرارة التلدين بشكل عام 5 ℃ أقل من Tm من التمهيدي.
هناك العديد من الصيغ لضبط Tm ، والتي تختلف اختلافًا كبيرًا اعتمادًا على الصيغة المستخدمة وتسلسل البادئات.نظرًا لأن معظم الصيغ توفر قيمة Tm تقديرية ، فإن جميع درجات حرارة التلدين ليست سوى نقطة بداية.يمكن تحسين النوعية من خلال تحليل العديد من التفاعلات التي ترفع درجة حرارة التلدين تدريجيًا.ابدأ بأقل من Tm-5 المقدرة ، وقم بزيادة درجة حرارة التلدين تدريجياً بزيادة 2 ℃.ستعمل درجة حرارة التلدين العالية على تقليل تكوين ثنائيات التمهيدي والمنتجات غير المحددة.للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن يكون للبادرين قيم تقريبية لـ Tm.إذا كان الفرق Tm لأزواج التمهيدي أكثر من 5 ℃ ، فإن البادئات ستظهر بداية خاطئة كبيرة باستخدام درجة حرارة تلدين أقل في الدورة.في حالة اختلاف البادئين Tm ، اضبط درجة حرارة التلدين على 5 درجات أقل من أدنى درجة حرارة Tm.بدلاً من ذلك ، لزيادة الخصوصية ، يمكن إجراء خمس دورات أولاً في درجات حرارة التلدين المصممة ل Tm أعلى ، تليها الدورات المتبقية عند درجات حرارة التلدين المصممة ل Tm أقل.يسمح هذا بالحصول على نسخة جزئية من قالب الوجهة في ظل ظروف ضيقة.
4. نقاء وثبات التمهيدي
النقاء القياسي للبادئات المخصصة مناسب لمعظم تطبيقات PCR.تعتبر إزالة مجموعتي البنزويل والأيزوبوتيلي عن طريق التحلية ضئيلة وبالتالي لا تتداخل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل.تتطلب بعض التطبيقات تنقية لإزالة أي تسلسلات غير كاملة الطول في عملية التوليف.تحدث هذه التسلسلات المبتورة لأن كفاءة كيمياء تخليق الحمض النووي ليست 100٪.هذه عملية دائرية تستخدم تفاعلات كيميائية متكررة حيث تتم إضافة كل قاعدة لصنع DNA من 3 ′ إلى 5 ′.يمكنك أن تفشل في أي من الدورتين.تحتوي البادئات الأطول ، خاصة تلك الأكبر من 50 قاعدة ، على نسبة كبيرة من التسلسلات المقطوعة وقد تتطلب تنقية.
يتأثر مردود البادئات بكفاءة الكيمياء التركيبية وطريقة التنقية.تستخدم شركات الأدوية الحيوية ، مثل علم الخلايا و Shengong ، حدًا أدنى لوحدة OD لضمان الناتج الإجمالي من قليل النوكليوزيد.يتم شحن البادئات المخصصة في شكل مسحوق جاف.من الأفضل إعادة إذابة البادئات في TE بحيث يكون التركيز النهائي 100 ميكرومتر.يعتبر TE أفضل من الماء منزوع الأيونات لأن الرقم الهيدروجيني للماء غالبًا ما يكون حمضيًا وسيؤدي إلى التحلل المائي لأوليغنوكليوسيدات.
يعتمد ثبات البادئات على ظروف التخزين.يجب تخزين المسحوق الجاف والبادئات الذائبة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.يمكن تخزين المواد التمهيدية المذابة في TE بتركيزات أكبر من 10 ميكرومتر بشكل ثابت عند -20 لمدة 6 أشهر ، ولكن يمكن تخزينها فقط في درجة حرارة الغرفة (15 إلى 30) لمدة تقل عن أسبوع.يمكن تخزين بودرة المسحوق الجافة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة سنة واحدة على الأقل وفي درجة حرارة الغرفة (15 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية) لمدة تصل إلى شهرين.
5. الإنزيمات وتركيزاتها
في الوقت الحاضر ، فإن بوليميراز DNA Taq المستخدم هو في الأساس إنزيم هندسة الجينات الذي تم تصنيعه بواسطة البكتيريا القولونية.كمية الإنزيم اللازمة لتحفيز تفاعل PCR النموذجي حوالي 2.5U (يشير إلى الحجم الكلي للتفاعل 100ul).إذا كان التركيز مرتفعًا جدًا ، فقد يؤدي إلى تضخيم غير محدد ؛إذا كان التركيز منخفضًا جدًا ، فسيتم تقليل كمية المنتج الصناعي.
6. جودة وتركيز dNTP
ترتبط جودة dNTP ارتباطًا وثيقًا بتركيز وفعالية تضخيم PCR.مسحوق dNTP حبيبي ، ويفقد تنوعه نشاطه البيولوجي إذا تم تخزينه بشكل غير صحيح.محلول dNTP حمضي ، ويجب استخدامه بتركيز عالٍ ، مع محلول عازلة 1M NaOH أو 1M Tris.HCL لضبط درجة الحموضة إلى 7.0 ~ 7.5 ، كمية صغيرة من العبوات الفرعية ، التخزين المجمد عند -20.سوف يؤدي التجميد المتعدد للذوبان إلى تدهور dNTP.في تفاعل PCR ، يجب أن يكون dNTP 50 ~ 200 ميومول / لتر.على وجه الخصوص ، يجب الانتباه إلى أن تركيز DNTPS الأربعة يجب أن يكون متساويًا (تحضير الخلد المتساوي).إذا كان تركيز أي منهم مختلفًا عن الآخرين (أعلى أو أقل) ، فسيحدث عدم التطابق.التركيز المنخفض جدًا سيقلل من إنتاجية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل.يمكن أن تتحد dNTP مع Mg2 + وتقليل تركيز Mg2 + المجاني.
7. قالب (الجين المستهدف) الحمض النووي
تعد كمية ودرجة تنقية الحمض النووي النموذجي أحد الروابط الرئيسية لنجاح أو فشل PCR.عادةً ما تستخدم طرق تنقية الحمض النووي التقليدية SDS والبروتياز K لهضم العينات والتخلص منها.الوظائف الرئيسية لـ SDS هي: إذابة الدهون والبروتينات على غشاء الخلية ، وبالتالي تدمير غشاء الخلية عن طريق إذابة بروتينات الغشاء ، وفصل البروتينات النووية في الخلية ، ويمكن أيضًا أن تتحد SDS مع البروتينات وترسب ؛يمكن للبروتياز K أن يتحلل وهضم البروتينات ، وخاصة الهستونات المرتبطة بالحمض النووي ، ثم يستخدم المذيب العضوي الفينول والكلوروفورم لاستخراج البروتينات ومكونات الخلايا الأخرى ، واستخدام الإيثانول أو كحول الأيزوبروبيل لترسيب الحمض النووي.يمكن استخدام الحمض النووي المستخرج كقالب لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل.بالنسبة لعينات الكشف السريري العامة ، يمكن استخدام طريقة سريعة وبسيطة لإذابة الخلايا ، وتحلل مسببات الأمراض ، وهضم البروتينات وإزالتها من الكروموسومات لتحرير الجينات المستهدفة ، واستخدامها مباشرة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.عادة ما يستخدم استخراج قالب الحمض النووي الريبي غوانيدين أيزوثيوسيانات أو طريقة البروتياز K لمنع RNase من تدهور الحمض النووي الريبي.
8.Mg2 + تركيز
Mg2 + له تأثير كبير على خصوصية وعائد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.بشكل عام تفاعل PCR ، عندما يكون تركيز dNTP المختلف 200 ميومول / لتر ، يكون التركيز المناسب لـ Mg2 + 1.5 ~ 2.0mmol / L.تركيز Mg2 + مرتفع للغاية ، وتقل خصائص التفاعل ، ويحدث تضخيم غير محدد ، وسيقلل التركيز المنخفض جدًا من نشاط بوليميريز DNA Taq ، مما يؤدي إلى تقليل منتجات التفاعل.
تؤثر أيونات المغنيسيوم على العديد من جوانب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل نشاط بوليميراز الدنا الذي يؤثر على المحصول ؛مثال آخر هو التلدين التمهيدي ، والذي يؤثر على الخصوصية.يرتبط dNTP والقالب بأيون المغنيسيوم ، مما يقلل من كمية أيون المغنيسيوم الحر المطلوب لنشاط الإنزيم.يختلف تركيز أيون المغنيسيوم الأمثل باختلاف أزواج وقوالب التمهيدي ، ولكن تركيز بدء PCR النموذجي مع 200 ميكرومتر dNTP هو 1.5 ملي مولار (ملاحظة: بالنسبة إلى PCR الكمي في الوقت الحقيقي ، استخدم 3 إلى 5 ملي مولار من محلول أيون المغنيسيوم مع مسبار الفلورسنت).تزيد التركيزات الأعلى من أيونات المغنيسيوم الحرة من المحصول ، ولكنها تزيد أيضًا من التضخيم غير المحدد وتقلل من الدقة.لتحديد التركيز الأمثل ، تم إجراء معايرة أيون المغنيسيوم بزيادات قدرها 0.5 ملي مولار من 1 ملم إلى 3 ملم.لتقليل الاعتماد على تحسين أيون المغنيسيوم ، يمكن استخدام بلاتينيوم طق DNA بوليميراز.بلاتينيوم طاق DNA polymerase قادر على الحفاظ على الوظيفة على مدى أوسع من تركيزات أيون المغنيسيوم من Taq DNA polymerase وبالتالي يتطلب تحسينًا أقل.
9. المضافات المعززة للـ PCR
يعد تحسين درجة حرارة التلدين وتصميم التمهيدي وتركيز أيون المغنيسيوم كافياً لتضخيم محدد للغاية لمعظم القوالب ؛ومع ذلك ، تتطلب بعض القوالب ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على محتوى عالٍ من GC ، إجراءات إضافية.توفر الإضافات التي تؤثر على درجة حرارة انصهار الحمض النووي طريقة أخرى لتحسين خصوصية المنتج والإنتاجية.مطلوب تمسخ كامل للقالب للحصول على أفضل النتائج.
بالإضافة إلى ذلك ، يمنع الهيكل الثانوي ارتباط التمهيدي وتمديد الإنزيم.
إضافات PCR ، بما في ذلك فورماميد ، DMSO ، الجلسرين ، البيتين ، و PCRx Enhancer Solution ، تعزز التضخيم.تتمثل آليتها المحتملة في تقليل درجة حرارة الانصهار ، وبالتالي المساعدة في تلدين المواد الأولية والمساعدة في تمديد بوليميريز الحمض النووي عبر منطقة البنية الثانوية.PCRx Solution له مزايا أخرى.مطلوب الحد الأدنى من تحسين أيون المغنيسيوم عند استخدامه مع بلاتينيوم Taq DNA polymerase و Platinum Pfx DNA polymerase.وبالتالي ، يتم دمج تقنية Platinum مع المادة المضافة لزيادة الخصوصية مع تقليل الاعتماد على النهج الثالث ، وهو تحسين أيون المغنيسيوم.للحصول على أفضل النتائج ، يجب تحسين تركيز المواد المضافة ، خاصة DMSO ، فورماميد ، والجليسرول ، والتي تثبط بوليميريز DNA Taq.
10. بداية ساخنة
يعد Hot start PCR أحد أهم الطرق لتحسين خصوصية PCR بالإضافة إلى التصميم التمهيدي الجيد.على الرغم من أن درجة حرارة الاستطالة المثلى لـ Taq DNA polymerase هي 72 ℃ ، فإن البوليميراز يظل نشطًا في درجة حرارة الغرفة.وبالتالي ، يتم إنتاج منتجات غير محددة عندما تكون درجة حرارة التثبيت أقل من درجة حرارة التلدين أثناء تحضير تفاعل PCR وفي بداية الدورة الحرارية.بمجرد تشكيلها ، يتم تضخيم هذه المنتجات غير المحددة بشكل فعال.يكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (Hot-start PCR) فعالاً بشكل خاص عندما تكون المواقع المستخدمة في التصميم التمهيدي محدودة بموقع العناصر الجينية ، مثل الطفرات الموجهة للموقع ، أو استنساخ التعبير ، أو بناء العناصر الجينية المستخدمة في هندسة الحمض النووي ومعالجتها.
تتمثل إحدى الطرق الشائعة للحد من نشاط بوليميريز DNA Taq في تحضير محلول تفاعل PCR على الجليد ووضعه في جهاز PCR مسخن مسبقًا.هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة ، لكنها لا تكمل نشاط الإنزيم وبالتالي لا تقضي تمامًا على تضخيم المنتجات غير المحددة.
يؤخر التحضير الحراري تخليق الحمض النووي عن طريق تثبيط مكون أساسي حتى يصل جهاز PCR إلى درجة حرارة تمسخ.تعتبر معظم طرق البدء الحراري اليدوية ، بما في ذلك الإضافة المتأخرة لـ Taq DNA polymerase ، مرهقة ، خاصة للتطبيقات عالية الإنتاجية.تستخدم طرق التحضير الحراري الأخرى درعًا شمعيًا لإحاطة مكون أساسي ، بما في ذلك أيونات المغنيسيوم أو الإنزيمات ، أو لعزل المكونات التفاعلية ، مثل القوالب والمخازن المؤقتة.أثناء الدورة الحرارية ، يتم إطلاق المكونات المختلفة وخلطها معًا عندما يذوب الشمع.مثل طريقة البداية الساخنة اليدوية ، فإن طريقة درع الشمع مرهقة وعرضة للتلوث وليست مناسبة للتطبيقات عالية الإنتاجية.
إن بلميراز DNA البلاتيني مناسب وفعال لبدء التشغيل التلقائي لـ PCR.يتكون بوليميراز DNA Taq البلاتيني من بوليميريز Taq DNA المؤتلف مع جسم مضاد أحادي النسيلة ضد بوليميريز DNA Taq.تصاغ الأجسام المضادة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتثبيط نشاط الإنزيم أثناء الاحتفاظ بدرجة الحرارة لفترات طويلة.تم إطلاق بوليميريز DNA Taq في التفاعل أثناء العزل 94 درجة لخطوة التمسخ ، واستعادة نشاط البلمرة الكامل.على عكس بوليميراز DNA Taq المعدل كيميائياً من أجل البدء الحراري ، لا يتطلب إنزيم البلاتين عزلًا مطولًا عند 94 درجة مئوية (10 إلى 15 دقيقة) لتنشيط البوليميراز.مع بلاتينيتاك DNA polymerase ، تمت استعادة 90٪ من نشاط بوليميريز DNA Taq بعد دقيقتين عند 94.
11. عش- PCR
يمكن للجولات المتتالية من التضخيم باستخدام الاشعال المتداخلة تحسين الخصوصية والحساسية.الجولة الأولى عبارة عن تضخيم قياسي يتراوح من 15 إلى 20 دورة.تم تخفيف جزء صغير من منتج التضخيم الأولي 100 إلى 1000 مرة وإضافته إلى الجولة الثانية من التضخيم لمدة 15 إلى 20 دورة.بدلاً من ذلك ، يمكن تغيير حجم المنتج المضخم الأولي عن طريق تنقية الهلام.يتم استخدام التمهيدي المتداخل في الجولة الثانية من التضخيم ، والذي يمكن أن يرتبط بالتسلسل المستهدف داخل التمهيدي الأول.يقلل استخدام PCR المتداخل من إمكانية تضخيم المواقع المستهدفة المتعددة نظرًا لوجود عدد قليل من التسلسلات المستهدفة المكملة لكلا مجموعتي البادئات.نفس العدد الإجمالي للدورات (30 إلى 40) مع نفس الاشعال تضخيم المواقع غير المحددة.يزيد تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل من حساسية التسلسلات المستهدفة المحدودة (على سبيل المثال ، مرناس نادر) ويحسن خصوصية PCRS الصعبة (على سبيل المثال 5 ′ RACE).
12. تنازلي PCR
يحسن تنازلي تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعية باستخدام شروط التلدين الضيقة للدورات القليلة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.تبدأ الدورة عند درجة حرارة التلدين حوالي 5 أعلى من Tm المقدرة ، ثم تنخفض كل دورة بمقدار 1 إلى 2 حتى تكون درجة حرارة التلدين أقل من Tm 5.سيتم تضخيم قالب الوجهة الذي يحتوي على أعلى تماثل فقط.تستمر هذه المنتجات في التوسع في الدورات اللاحقة ، مما يؤدي إلى استبعاد المنتجات غير المحددة المضخمة.تنازلي PCR مفيد للطرق التي لا تُعرف فيها درجة التماثل بين التمهيدي والقالب المستهدف ، مثل بصمة AFLP DNA.
مجموعات PCR ذات الصلة
2 × بطل PCRTMيتمتع نظام Mix بتسامح أعلى لمثبطات PCR مقارنة بنظام PCR Mix العادي ، ويمكنه بسهولة التعامل مع تضخيم PCR لقوالب معقدة متنوعة.يجعل نظام التفاعل الفريد والكفاءة العالية Taq Hero تفاعل PCR يتمتع بكفاءة تضخيم أعلى وخصوصية وحساسية.
كفاءة تضخيم أعلى
يحتوي على نشاط 5 '→ 3' DNA polymerase و 5 '→ 3' نشاط نوكلياز خارجي ، بدون نشاط 3 '→ 5' نوكلياز خارجي.
الوقت الحقيقي PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
محدد - يمكن أن يمنع إنزيم Taq المحسّن والبدء الساخن التضخيم غير المحدد وتشكيل باهت التمهيدي
حساسية عالية - يمكنها الكشف عن النسخ المنخفضة من النموذج
تستخدم المجموعة كاشف النسخ العكسي الفريد Foregene و Foregene HotStar Taq DNA Polymerase جنبًا إلى جنب مع نظام تفاعل فريد لتحسين كفاءة التضخيم وخصوصية التفاعل بشكل فعال.
الوقت ما بعد: 09 - 2023 مايو
