一 、 زيادة حساسية نظام التفاعل ：

1. عزل جودة عالية من الحمض النووي الريبي ：

يأتي تخليق (كدنا) الناجح من الحمض النووي الريبي عالي الجودة.يجب أن يكون الحمض النووي الريبي عالي الجودة كامل الطول على الأقل وخاليًا من مثبطات النسخ العكسي مثل EDTA أو SDS.تحدد جودة الحمض النووي الريبي أقصى قدر من معلومات التسلسل التي يمكنك نسخها إلى cDNA.طريقة تنقية الحمض النووي الريبي الشائعة هي طريقة من خطوة واحدة باستخدام غوانيدين أيزوثيوسيانات / حمض الفينول.لمنع التلوث بكميات ضئيلة من RNase ، يجب تخزين الحمض النووي الريبي المعزول من العينات الغنية بالـ RNase (مثل البنكرياس) في الفورمالديهايد للحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة ، خاصة للتخزين طويل الأجل.تم تحلل الحمض النووي الريبي المستخرج من كبد الفئران بشكل أساسي بعد تخزينه في الماء لمدة أسبوع واحد ، بينما ظل الحمض النووي الريبي المستخرج من طحال الفئران مستقرًا بعد تخزينه في الماء لمدة 3 سنوات.بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر النصوص التي يزيد طولها عن 4 كيلو بايت أكثر حساسية للتدهور بواسطة تتبع RNases من النصوص الصغيرة.لزيادة استقرار عينات الحمض النووي الريبي المخزنة ، يمكن إذابة الحمض النووي الريبي في فورماميد منزوع الأيونات وتخزينه عند -70 درجة مئوية.يجب أن يكون Formamide المستخدم لحفظ الحمض النووي الريبي خاليًا من الحطام المهين للحمض النووي الريبي.يمكن حفظ الحمض النووي الريبي من البنكرياس في فورماميد لمدة عام على الأقل.عند التحضير لاستخدام الحمض النووي الريبي ، يمكنك استخدام الطريقة التالية لترسيب الحمض النووي الريبي: إضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.2M و 4 أضعاف حجم الإيثانول ، ووضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق ، والطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 5 دقائق.

2. استخدم إنزيم النسخ العكسي RNaseH غير النشط (RNaseH-) ：

غالبًا ما تُضاف مثبطات RNase لعكس تفاعلات النسخ لزيادة طول وإنتاج تخليق (كدنا).يجب إضافة مثبطات RNase أثناء تفاعل التوليف الأول في وجود مخزن مؤقت وعامل اختزال (مثل DTT) ، لأن العملية السابقة لتخليق cDNA تفسد المانع ، وبالتالي إطلاق RNase المرتبط الذي يمكن أن يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي.تمنع مثبطات البروتين RNase فقط تدهور الحمض النووي الريبي بواسطة RNase A و B و C ولا تمنع RNase على الجلد ، لذا احرص على عدم إدخال RNase من أصابعك على الرغم من استخدام هذه المثبطات.

إن إنزيم النسخ العكسي يحفز تحويل الحمض النووي الريبي إلى (كدنا).كل من M-MLV و AMV لهما نشاط RNaseH داخلي بالإضافة إلى نشاط البوليميراز الخاص بهما.يتنافس نشاط RNaseH ونشاط البوليميراز مع بعضهما البعض على الخيط الهجين المتكون بين قالب RNA و DNA التمهيدي أو حبلا تمديد cDNA ، ويؤديان إلى تدهور RNA في RNA: DNA complex.لم يعد قالب الحمض النووي الريبي المتدهور بفعل نشاط RNaseH بمثابة ركيزة فعالة لتخليق (كدنا) ، مما يقلل من إنتاج وطول تخليق (كدنا).لذلك ، سيكون من المفيد القضاء على نشاط RNaseH للنسخ العكسي أو تقليله بشكل كبير.

SuperScript Ⅱ النسخ العكسي للنسخة العكسية RNaseH- MMLV ونسخة النسخ العكسي بالحرارة ، RNaseH- AMV ، يمكن الحصول على كمية أكبر وأكثر من cDNA كامل الطول من MMLV و AMV.سوف تتأثر حساسية RT-PCR بكمية تخليق (كدنا).يعتبر ThermoScript أكثر حساسية من AMV.يقتصر حجم منتجات RT-PCR على قدرة النسخ العكسي على تخليق cDNA ، خاصة عند استنساخ cDNAs الأكبر.مقارنةً بـ MMLV ، زادت SuperScrip بشكل كبير من إنتاجية منتجات RT-PCR الطويلة.كما أن إنزيم النسخ العكسي لـ RNaseH زاد من ثبات الحرارة ، لذلك يمكن إجراء التفاعل في درجات حرارة أعلى من 37-42 درجة مئوية العادية.في ظل ظروف التوليف المقترحة ، استخدم أوليغو (dT) التمهيدي و 10 μCi من [α-P] dCTP.تم حساب الناتج الإجمالي للحبلة الأولى باستخدام طريقة ترسيب TCA.تم تحليل (كدنا) كامل الطول باستخدام نطاقات مرتبة حسب الحجم مستأصلة وعدها على هلام الاغاروز القلوي.

3. ارفع درجة حرارة الحضانة للنسخ العكسي ：

تساعد درجة حرارة التفريخ المرتفعة على فتح البنية الثانوية للحمض النووي الريبي ، مما يزيد من مردود التفاعل.بالنسبة لمعظم قوالب الحمض النووي الريبي ، فإن احتضان الحمض النووي الريبي والبادئات عند 65 درجة مئوية بدون عازلة أو ملح ، متبوعًا بالتبريد السريع على الجليد ، سيقضي على معظم الهياكل الثانوية ويسمح للاشعال بالارتباط.ومع ذلك ، لا تزال بعض القوالب تحتوي على هياكل ثانوية ، حتى بعد تمسخ الحرارة.يمكن إجراء تضخيم هذه القوالب الصعبة باستخدام ThermoScript Reverse Transcriptase ووضع رد فعل النسخ العكسي عند درجة حرارة أعلى لتحسين التضخيم.يمكن أيضًا أن تزيد درجات حرارة الحضانة المرتفعة من النوعية ، خاصةً عند استخدام البادئات الخاصة بالجينات (GSP) لتخليق cDNA (انظر الفصل 3).في حالة استخدام نظام الأفضليات المعمم ، تأكد من أن Tm الخاص بالبادئات هو نفس درجة حرارة الحضانة المتوقعة.لا تستخدم الأوليجو (dT) والبادئات العشوائية فوق 60 درجة مئوية.تتطلب المواد الأولية العشوائية الحضانة عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل أن تزيد إلى 60 درجة مئوية.بالإضافة إلى استخدام درجة حرارة نسخ عكسي أعلى ، يمكن أيضًا تحسين النوعية عن طريق النقل المباشر لمزيج RNA / التمهيدي من درجة حرارة تمسخ 65 درجة مئوية إلى درجة حرارة حضانة النسخ العكسي وإضافة خليط تفاعل 2 × مُسخَّن مسبقًا (توليف بدء التشغيل الساخن cDNA).يساعد هذا النهج في منع الاقتران بين الجزيئات الأساسي الذي يحدث في درجات حرارة منخفضة.يمكن تبسيط تبديل درجات الحرارة المتعددة المطلوب لـ RT-PCR باستخدام جهاز تدوير حراري.

يعمل البوليميراز القابل للحرارة Tth كبوليميراز DNA في وجود Mg2 + وكبوليميراز RNA في وجود Mn2 +.يمكن الاحتفاظ بها دافئة عند درجة حرارة أقصاها 65 درجة مئوية.ومع ذلك ، فإن وجود Mn2 + أثناء PCR يقلل من الدقة ، مما يجعل Tth polymerase أقل ملاءمة للتضخيم عالي الدقة ، مثل استنساخ cDNA.بالإضافة إلى ذلك ، يتمتع Tth بكفاءة نسخ عكسي منخفضة ، مما يقلل من الحساسية ، وبما أنه يمكن إجراء النسخ العكسي و PCR باستخدام إنزيم واحد ، فلا يمكن استخدام تفاعلات التحكم دون النسخ العكسي لمقارنة منتجات تضخيم (كدنا) مع تلوث الحمض النووي الجيني.تم فصل منتجات التضخيم.

4. الإضافات التي تعزز النسخ العكسي ：

تتم إضافة المواد المضافة بما في ذلك الجلسرين و DMSO إلى تفاعل تخليق الخيط الأول ، والذي يمكن أن يقلل من ثبات الشريط المزدوج للحمض النووي ويفك الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي.يمكن إضافة ما يصل إلى 20٪ جلسرين أو 10٪ DMSO دون التأثير على نشاط SuperScript II أو MMLV.يمكن أن يتحمل AMV أيضًا ما يصل إلى 20٪ من الجلسرين دون فقدان النشاط.من أجل تعظيم حساسية RT-PCR في تفاعل النسخ العكسي SuperScript ، يمكن إضافة 10 ٪ من الجلسرين واحتضانها عند 45 درجة مئوية.إذا تمت إضافة 1/10 من منتج تفاعل النسخ العكسي إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فإن تركيز الجلسرين في تفاعل التضخيم يكون 0.4٪ ، وهو ما لا يكفي لتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل.

5. علاج RNaseH ：

يمكن أن يؤدي علاج تفاعلات تخليق (كدنا) مع RNaseH قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى زيادة الحساسية.بالنسبة لبعض القوالب ، يُعتقد أن الحمض النووي الريبي في تفاعل تخليق cDNA يمنع ارتباط منتجات التضخيم ، وفي هذه الحالة يمكن أن يزيد علاج RNaseH من الحساسية.بشكل عام ، يعد علاج RNaseH ضروريًا عند تضخيم القوالب المستهدفة الأطول كاملة الطول (كدنا) ، مثل داء الشَرَزُحِيّ المنخفض النسخ الثاني.بالنسبة لهذا القالب الصعب ، عززت معالجة RNaseH الإشارة التي تنتجها SuperScript II أو AMV-synthesized cDNA.بالنسبة لمعظم تفاعلات RT-PCR ، يكون علاج RNaseH اختياريًا ، لأن خطوة تمسخ PCR عند 95 درجة مئوية تتحلل بشكل عام الحمض النووي الريبي في RNA: مجمع DNA.

6. تحسين طريقة الكشف عن الحمض النووي الريبي الصغير ：

يعتبر RT-PCR تحديًا بشكل خاص عند توفر كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي.يساعد الجليكوجين المضاف كحامل أثناء عزل الحمض النووي الريبي على زيادة إنتاجية العينات الصغيرة.يمكن إضافة الجليكوجين الخالي من RNase في نفس وقت إضافة Trizol.الجليكوجين قابل للذوبان في الماء ويمكن الاحتفاظ به في المرحلة المائية باستخدام الحمض النووي الريبي للمساعدة في الترسيب اللاحق.بالنسبة للعينات التي تقل عن 50 مجم من الأنسجة أو 106 خلية مزروعة ، فإن التركيز الموصى به من الجليكوجين الخالي من RNase هو 250 ميكروغرام / مل.

يمكن أن تؤدي إضافة BSA الأسيتيل إلى تفاعل النسخ العكسي باستخدام SuperScript II إلى زيادة الحساسية ، وبالنسبة للكميات الصغيرة من الحمض النووي الريبي ، فإن تقليل كمية SuperScript II وإضافة 40 وحدة من مثبط نوكلياز RNaseOut يمكن أن يزيد من مستوى الكشف.إذا تم استخدام الجليكوجين في عملية عزل الحمض النووي الريبي ، فلا يزال يوصى بإضافة BSA أو مثبط RNase عند استخدام SuperScript II لتفاعل النسخ العكسي.

二 、 زيادة خصوصية RT-PCR

1. CND Asynthesis ：

يمكن بدء تخليق أول حبلا (كدنا) باستخدام ثلاث طرق مختلفة ، تؤثر خصوصيتها النسبية على كمية ونوع (كدنا) المركب.

كانت طريقة التمهيدي العشوائي هي الأقل تحديدًا من بين الطرق الثلاث.تصلب الاشعال في مواقع متعددة في جميع أنحاء النص ، وتولد cDNAs قصيرة وجزئية الطول.تُستخدم هذه الطريقة بشكل متكرر للحصول على تسلسلات 5-end وللحصول على cDNA من قوالب RNA مع مناطق بنية ثانوية أو مع مواقع إنهاء لا يمكن نسخها عن طريق النسخ العكسي.للحصول على أطول (كدنا) ، يجب تحديد نسبة البادئات إلى الحمض النووي الريبي في كل عينة من الحمض النووي الريبي تجريبياً.تراوح تركيز البداية من البادئات العشوائية من 50 إلى 250 نانوغرام لكل 20 ميكرولتر من التفاعل.نظرًا لأن (كدنا) المركب من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الاشعال العشوائي هو في المقام الأول RNA ريبوزومي ، يتم اختيار بولي (A) + RNA عمومًا كقالب.

البادئات Oligo (dT) أكثر تحديدًا من البادئات العشوائية.يتم تهجينه إلى ذيل بولي (A) الموجود في الطرف 3 لمعظم جزيئات الرنا المرسال حقيقية النواة.نظرًا لأن poly (A) + RNA حوالي 1٪ إلى 2٪ من إجمالي RNA ، فإن كمية وتعقيد cDNA أقل بكثير من تلك الموجودة في البادئات العشوائية.بسبب خصوصيته العالية ، لا يتطلب oligo (dT) عمومًا تحسين نسبة RNA إلى البادئات واختيار poly (A) +.يوصى باستخدام 0.5 ميكروغرام أوليغو (dT) لكل 20 مايكرولتر من نظام التفاعل.oligo (dT) 12-18 مناسب لمعظم RT-PCR.يوفر نظام ThermoScript RT-PCR نظام oligo (dT) 20 نظرًا لاستقراره الحراري الأفضل لدرجات حرارة حضانة أعلى.

البادئات الخاصة بالجينات (GSP) هي أكثر البادئات تحديدًا لخطوة النسخ العكسي.GSP هو أليغنوكليوتيد مضاد للحساسية يمكنه التهجين على وجه التحديد مع التسلسل المستهدف للحمض النووي الريبي ، على عكس البادئات العشوائية أو الأوليجو (dT) ، التي تصلب جميع الرناوات.تنطبق نفس القواعد المستخدمة في تصميم بادئات PCR على تصميم GSP في تفاعلات النسخ العكسي.يمكن أن يكون GSP هو نفس تسلسل تمهيدي التضخيم الذي يصلب إلى نهاية 3′-most من mRNA ، أو يمكن تصميم GSP لتصلب المصب التمهيدي للتضخيم العكسي.بالنسبة لبعض الموضوعات التي تم تضخيمها ، يجب تصميم أكثر من أساس واحد مضاد للحساسية من أجل RT-PCR ناجح لأن البنية الثانوية للحمض النووي الريبي المستهدف قد تمنع الارتباط التمهيدي.يوصى باستخدام 1 pmol antisense GSP في 20 ميكرولتر من تفاعل توليف أول حبلا.

2. رفع درجة حرارة الحضانة للنسخ العكسي ：

من أجل الاستفادة الكاملة من الميزة الكاملة لخصوصية نظام الأفضليات المعمم ، يجب استخدام نسخة عكسية ذات ثبات حراري أعلى.يمكن تحضين النسخ العكسية القابلة للحرارة في درجات حرارة أعلى لزيادة صرامة التفاعل.على سبيل المثال ، إذا كان نظام الأفضليات المعمم يصلب عند 55 درجة مئوية ، فلن يتم استخدام خصوصية نظام الأفضليات المعمم بشكل كامل إذا تم استخدام AMV أو M-MLV للنسخ العكسي بصرامة منخفضة تبلغ 37 درجة مئوية.ومع ذلك ، يمكن تفاعل SuperScript II و ThermoScript عند 50 درجة مئوية أو أعلى ، مما يلغي المنتجات غير المحددة التي يتم إنشاؤها في درجات حرارة منخفضة.للحصول على أقصى قدر من الخصوصية ، يمكن نقل مزيج RNA / التمهيدي مباشرة من درجة حرارة تمسخ 65 درجة مئوية إلى درجة حرارة حضانة النسخ العكسي وإضافته إلى مزيج تفاعل 2 × تم تسخينه مسبقًا (بداية ساخنة لتوليف (كدنا)).هذا يساعد على منع الاقتران بين الجزيئات الأساسية في درجات حرارة منخفضة.يمكن تبسيط انتقالات درجة الحرارة المتعددة المطلوبة لـ RT-PCR باستخدام جهاز تدوير حراري.

3. يقلل من تلوث الحمض النووي الجيني ：

تتمثل إحدى الصعوبات المحتملة التي تواجهها RT-PCR في تلوث الحمض النووي الجيني في الحمض النووي الريبي.سيؤدي استخدام طريقة عزل RNA جيدة ، مثل Trizol Reagent ، إلى تقليل كمية الحمض النووي الجيني الذي يلوث إعداد الحمض النووي الريبي.لتجنب المنتجات المشتقة من الحمض النووي الجيني ، يمكن معالجة الحمض النووي الريبي باستخدام DNase I بدرجة تضخيم لإزالة الحمض النووي الملوث قبل النسخ العكسي.تم إنهاء عملية هضم DNase I عن طريق احتضان العينات في 2.0 ملي مولار EDTA لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية.يمكن لـ EDTA أن يخلب أيونات المغنيسيوم ، مما يمنع تحلل الحمض النووي الريبي المعتمد على أيونات المغنيسيوم في درجات حرارة عالية.

من أجل فصل cDNA المضخم عن تلويث منتجات تضخيم الحمض النووي الجيني ، يمكن تصميم الاشعال بحيث يصلب كل منها لفصل exons.ستكون منتجات PCR المشتقة من (كدنا) أقصر من تلك المشتقة من الحمض النووي الجيني الملوث.بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تجربة تحكم بدون نسخ عكسي على كل قالب RNA لتحديد ما إذا كان جزء معين مشتق من الحمض النووي الجيني أو cDNA.منتج PCR الذي تم الحصول عليه بدون نسخ عكسي مشتق من الجينوم.