1. المعرفة الأساسية (إذا كنت تريد مشاهدة الجزء التجريبي ، فيرجى النقل مباشرة إلى الجزء الثاني)
كتفاعل مشتق من PCR التقليدي ، يراقب Real time PCR بشكل أساسي تغيير كمية منتج التضخيم في كل دورة من تفاعل تضخيم PCR في الوقت الفعلي من خلال تغيير إشارة التألق ، ويقوم بتحليل نموذجي كميًا من خلال العلاقة بين قيمة ct والمنحنى القياسي.
البيانات المحددة لـ RT-PCR هيحدود, عتبة الأسفاروقيمة ط م.
| حدود: | قيمة التألق للدورة الثالثة إلى الخامسة عشرة هي خط الأساس (خط الأساس) ، والذي ينتج عن خطأ عرضي في القياس. |
| عتبة (عتبة): | يشير إلى حد الكشف عن التألق المحدد في موضع مناسب في منطقة النمو الأسي لمنحنى التضخيم ، وعمومًا 10 أضعاف الانحراف المعياري لخط الأساس. |
| قيمة CT: | هو عدد دورات PCR عندما تصل قيمة التألق في كل أنبوب رد فعل إلى العتبة. تتناسب قيمة Ct عكسيًا مع مقدار القالب الأولي. |
طرق وضع العلامات الشائعة لـ RT-PCR:
| طريقة | ميزة | عيب | نطاق التطبيق |
| SYBR الأخضرⅠ | قابلية تطبيق واسعة وحساسة ورخيصة ومريحة | متطلبات البرايمر عالية وعرضة لنطاقات غير محددة | وهي مناسبة للتحليل الكمي لمختلف الجينات المستهدفة ، والبحث في التعبير الجيني ، والبحث في الحيوانات والنباتات المعدلة وراثيا. |
| TaqMan | نوعية جيدة وقابلية عالية للتكرار | السعر مرتفع ومناسب فقط لأهداف محددة. | الكشف عن العوامل الممرضة ، أبحاث الجينات المقاومة للأدوية ، تقييم فاعلية الأدوية ، تشخيص الأمراض الوراثية. |
| منارة جزيئية | خصوصية عالية ، مضان ، خلفية منخفضة | السعر مرتفع ، وهو مناسب فقط لغرض معين ، والتصميم صعب ، والسعر مرتفع. | تحليل جيني محدد ، تحليل SNP |
2. خطوات تجريبية
2.1 حول التجميع التجريبي- يجب أن تكون هناك آبار متعددة في المجموعة ، ويجب أن يكون هناك تكرارات بيولوجية.
| ① | تحكم فارغ | تستخدم لاكتشاف حالة نمو الخلية في التجارب |
| ② | التحكم السلبي سيرنا (تسلسل سيرنا غير محدد) | إظهار خصوصية عمل RNAi.قد تحفز siRNA استجابة إجهاد غير محددة بتركيز 200 نانومتر. |
| ③ | التحكم في كاشف تعداء | استبعاد سمية كاشف تعداء الخلايا أو التأثير على التعبير عن الجين الهدف |
| ④ | سيرنا ضد الجين المستهدف | هدم تعبير الجين المستهدف |
| ⑤ (اختياري) | سيرنا إيجابي | تستخدم لاستكشاف مشاكل النظام والتشغيل التجريبي |
| ⑥ (اختياري) | الفلورسنت التحكم سيرنا | يمكن ملاحظة كفاءة تعداء الخلايا بالمجهر |
2.2 مبادئ التصميم التمهيدي
| حجم الجزء المضخم | يفضل عند 100-150 نقطة أساس |
| طول التمهيدي | 18-25 نقطة أساس |
| محتوى GC | 30٪ -70٪ ويفضل 45٪ -55٪ |
| قيمة TM | 58-60 |
| تسلسل | تجنب T / C المستمر ؛A / G مستمر |
| 3 نهاية تسلسل | تجنب GC rich أو AT rich ؛يفضل أن تكون القاعدة النهائية G أو C ؛من الأفضل تجنب T. |
| التكامل | تجنب التسلسلات التكميلية لأكثر من 3 قواعد داخل التمهيدي أو بين اثنين من البادئات |
| النوعية | استخدم البحث عن الانفجار لتأكيد خصوصية التمهيدي |
①SiRNA خاص بالأنواع ، وستكون تسلسلات الأنواع المختلفة مختلفة.
يتم تعبئة ②SiRNA في مسحوق مجفف بالتجميد ، والذي يمكن تخزينه بثبات لمدة 2-4 أسابيع في درجة حرارة الغرفة.
2.3 الأدوات أو الكواشف التي يجب تحضيرها مسبقًا
| التمهيدي (مرجع داخلي) | بما في ذلك اثنين إلى الأمام والخلف |
| الاشعال (الجين الهدف) | بما في ذلك اثنين إلى الأمام والخلف |
| Target Si RNA (3 شرائط) | بشكل عام ، ستقوم الشركة بتصنيع 3 شرائط ، ثم اختيار واحد من الثلاثة بواسطة RT-PCR |
| طقم تعداء | Lipo2000 إلخ. |
| طقم استخراج سريع الحمض النووي الريبي | لاستخراج الحمض النووي الريبي بعد تعداء |
| طقم النسخ العكسي السريع | لتوليف [كدنا] |
| طقم تضخيم PCR | 2 × سوبر SYBR جرين qPCR ماستر ميكس |
2.4 فيما يتعلق بالقضايا التي يجب الانتباه إليها في الخطوات التجريبية المحددة:
عملية تعداء ①siRNA
1. للطلاء ، يمكنك اختيار صفيحة ذات 24 بئر ، أو صفيحة ذات 12 بئر أو لوحة 6 بئر (متوسط تركيز الحمض النووي الريبي المقترح في كل بئر من لوحة 24 بئر هو حوالي 100-300 نانوغرام / مايكرولتر) ، وكثافة تعداء الخلايا المثلى تصل إلى 60٪ -80٪ أو نحو ذلك
2. إن خطوات تعداء العدوى والمتطلبات المحددة متوافقة تمامًا مع التعليمات.
3. بعد ترنسفكأيشن ، يمكن جمع العينات في غضون 24-72 ساعة للكشف عن الرنا المرسال (RT-PCR) أو الكشف عن البروتين في غضون 48-96 ساعة (WB)
② عملية استخراج الحمض النووي الريبي
1. منع التلوث بالأنزيمات الخارجية.وهي تشمل بشكل أساسي ارتداء الأقنعة والقفازات بدقة ؛باستخدام أطراف ماصة معقمة وأنابيب EP ؛يجب أن تكون المياه المستخدمة في التجربة خالية من RNase.
2. يوصى بعمل ضعف ما هو مقترح في مجموعة الاستخراج السريع ، مما سيحسن بالفعل النقاء والعائد.
3. يجب ألا يلمس سائل النفايات عمود الحمض النووي الريبي.
③ تقدير الحمض النووي الريبي
بعد استخراج الحمض النووي الريبي ، يمكن قياسه كميا مباشرة باستخدام Nanodrop ، ويمكن أن يكون الحد الأدنى للقراءة منخفضًا مثل 10ng / ul.
④ عملية النسخ العكسي
1. نظرًا للحساسية العالية لـ RT-qPCR ، يجب عمل 3 آبار متوازية على الأقل لكل عينة لمنع Ct اللاحقة من الاختلاف الشديد أو أن تكون SD كبيرة جدًا للتحليل الإحصائي.
2. لا تجمد وتذوب المزيج الرئيسي بشكل متكرر.
3. يجب استبدال كل أنبوب / ثقب بطرف جديد!لا تستخدم نفس طرف الماصة باستمرار لإضافة عينات!
4. يحتاج الفيلم الذي تم إرفاقه بلوحة 96-بئر بعد إضافة العينة إلى أن يتم صقله باستخدام صفيحة.من الأفضل استخدام الطرد المركزي قبل وضعه على الجهاز ، بحيث يتدفق السائل الموجود على جدار الأنبوب لأسفل ويزيل فقاعات الهواء.
⑤ تحليل المنحنى المشترك
| لا توجد فترة نمو لوغاريتمي | من المحتمل أن يكون تركيز القالب مرتفعًا |
| لا توجد قيمة CT | خطوات غير صحيحة للكشف عن إشارات الفلورسنت ؛ تدهور البادئات أو المجسات - يمكن الكشف عن سلامتها عن طريق الرحلان الكهربائي PAGE ؛ كمية غير كافية من القالب ؛ تدهور القوالب - تجنب إدخال الشوائب والتجميد المتكرر والذوبان في تحضير العينة ؛ |
| ط م> 38 | كفاءة تضخيم منخفضةمنتج PCR طويل جدًا ؛تتحلل مكونات التفاعل المختلفة |
| منحنى التضخيم الخطي | قد تتحلل المجسات جزئيًا عن طريق دورات التجميد-الذوبان المتكررة أو التعرض الطويل للضوء |
| الفرق في الثقوب المكررة كبير بشكل خاص | لا يتم إذابة محلول التفاعل تمامًا أو لا يتم خلط محلول التفاعل ؛الحمام الحراري لجهاز PCR ملوث بالمواد الفلورية |
2.5 حول تحليل البيانات
يمكن تقسيم تحليل بيانات qPCR إلى القياس الكمي النسبي والتقدير الكمي المطلق.على سبيل المثال ، الخلايا في مجموعة العلاج مقارنة بالخلايا في المجموعة الضابطة ،
كم مرة يتغير الرنا المرسال للجين X ، هذا هو التقدير الكمي النسبي ؛في عدد معين من الخلايا ، mRNA للجين X.
كم عدد النسخ هناك ، هذا هو التقدير الكمي المطلق.عادة أكثر ما نستخدمه في المختبر هو الطريقة الكمية النسبية.عادة،طريقة 2-ΔΔctهو الأكثر استخدامًا في التجارب ، لذلك سيتم تقديم هذه الطريقة فقط بالتفصيل هنا.
طريقة 2-ΔΔct: النتيجة التي تم الحصول عليها هي الاختلاف في التعبير عن الجين المستهدف في المجموعة التجريبية بالنسبة للجين المستهدف في المجموعة الضابطة.مطلوب أن تكون كفاءات التضخيم لكل من الجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي قريبة من 100٪ ، ويجب ألا يتجاوز الانحراف النسبي 5٪.
طريقة الحساب كالتالي:
مجموعة التحكم Δct = قيمة ct للجين المستهدف في مجموعة التحكم - قيمة ct للجين المرجعي الداخلي في مجموعة التحكم
المجموعة التجريبية Δct = قيمة ct للجين المستهدف في المجموعة التجريبية - قيمة ct للجين المرجعي الداخلي في المجموعة التجريبية
ΔΔct = Δct مجموعة تجريبية للمجموعة الضابطة Δct
أخيرًا ، احسب مضاعف الاختلاف في مستوى التعبير:
تغيير الطية = 2-ΔΔct (المقابلة لوظيفة excel هي POWER)
منتجات ذات صله:
الوقت ما بعد: 20 مايو 2023
