بدء المواد: RNA

النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) هي طريقة تجريبية مستخدمة في تجارب PCR باستخدام الحمض النووي الريبي كمادة البداية.في هذه الطريقة ، يتم نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي المرسال (مرنا) أولاً إلى الحمض النووي التكميلي (كدنا) عن طريق النسخ العكسي.بعد ذلك ، تم إجراء تفاعل qPCR باستخدام (كدنا) كقالب.تم استخدام RT-qPCR في مجموعة متنوعة من تطبيقات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليل التعبير الجيني ، والتحقق من تداخل الحمض النووي الريبي ، والتحقق من صحة المصفوفة الدقيقة ، واكتشاف مسببات الأمراض ، والاختبار الجيني ، وأبحاث الأمراض.

طرق من خطوة واحدة وخطوتين لـ RT-qPCR

يمكن إنجاز RT-qPCR بطريقة من خطوة واحدة أو خطوتين.تجمع RT-qPCR بخطوة واحدة بين النسخ العكسي وتضخيم PCR ، مما يسمح للنسخة العكسية وبوليميراز الحمض النووي بإكمال التفاعل في نفس الأنبوب تحت نفس ظروف المخزن المؤقت.يتطلب RT-qPCR بخطوة واحدة فقط استخدام مواد أولية خاصة بالتسلسل.في RT-qPCR من خطوتين ، يتم إجراء النسخ العكسي وتضخيم PCR في أنبوبين ، باستخدام مخازن مؤقتة محسّنة مختلفة ، وظروف رد فعل ، واستراتيجيات تصميم أولية.

منتجات ذات صله:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (خطوة واحدة) -SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (خطوة واحدة) -Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix لتوليف CDNA الأول

الوقت الحقيقي PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

الوقت الحقيقي PCR Easyᵀᴹ-Taqman

اختيار مجموع RNA و mRNA

عند تصميم تجربة RT-qPCR ، من المهم أن تقرر ما إذا كنت ستستخدم RNA الكلي أو mRNA المنقى كقالب للنسخ العكسي.على الرغم من أن الرنا المرسال قد يكون قادرًا على توفير حساسية أعلى قليلاً ، إلا أن إجمالي الحمض النووي الريبي لا يزال مستخدمًا بشكل متكرر.والسبب في ذلك هو أن إجمالي الحمض النووي الريبي يتمتع بميزة أكثر أهمية كمواد أولية من الرنا المرسال.أولاً ، تتطلب العملية خطوات تنقية أقل ، مما يضمن استردادًا كميًا أفضل للقالب وتطبيعًا أفضل للنتائج لأرقام الخلايا البادئة.ثانيًا ، يتجنب خطوة تخصيب mRNA ، والتي يمكن أن تتجنب احتمال حدوث نتائج منحرفة بسبب عمليات الاسترداد المختلفة للـ mRNAs المختلفة.بشكل عام ، نظرًا لأن التقدير الكمي النسبي للجين المستهدف في معظم التطبيقات أكثر أهمية من الحساسية المطلقة للكشف ، فإن إجمالي الحمض النووي الريبي أكثر ملاءمة في معظم الحالات.

التمهيدي النسخ العكسي

في الطريقة المكونة من خطوتين ، يمكن استخدام ثلاث طرق مختلفة لتهيئة تفاعل (كدنا): البادئات oligo (dT) ، أو الاشعال العشوائي ، أو الاشعال الخاص بالتسلسل.عادةً ما يتم استخدام البادئات oligo (dT) والبادئات العشوائية معًا.تصلب هذه المواد الأولية إلى حبلا mRNA النموذجي وتوفر النسخ العكسي مع نقطة انطلاق للتوليف.

النسخ العكسي

إن إنزيم النسخ العكسي هو إنزيم يستخدم الحمض النووي الريبي لتخليق الحمض النووي.بعض النسخ العكسية لها نشاط RNase ويمكن أن تتحلل من خيوط RNA في خيوط RNA-DNA الهجينة بعد النسخ.إذا لم يكن يحتوي على نشاط إنزيم RNase ، فيمكن إضافة RNaseH لزيادة كفاءة qPCR.تشمل الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع النسخ العكسي لفيروس سرطان الدم مولوني وفيروس الورم الأرومي النقوي الطيري.بالنسبة لـ RT-qPCR ، من المثالي اختيار نسخة عكسية ذات ثبات حراري أعلى ، بحيث يمكن إجراء تخليق (كدنا) في درجات حرارة أعلى ، مما يضمن النسخ الناجح للـ RNAs بهيكل ثانوي أعلى ، مع الحفاظ على نشاطها الكامل طوال التفاعل ، مما يؤدي إلى عوائد أعلى (كدنا).

منتجات ذات صله:

Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase

نشاط RNase H للنسخ العكسي

RNaseH قادر على تحطيم خيوط RNA من RNA-DNA المزدوج ، مما يسمح بالتوليف الفعال للحمض النووي المزدوج الشريطة.ومع ذلك ، عند استخدام mRNA طويل كقالب ، قد يتحلل الحمض النووي الريبي قبل الأوان ، مما يؤدي إلى اقتطاع (كدنا).لذلك ، غالبًا ما يكون من المفيد تقليل نشاط RNaseH أثناء استنساخ (كدنا) إذا كان تركيب النصوص الطويلة مطلوبًا.في المقابل ، غالبًا ما تكون النسخ العكسية مع نشاط RNase H مفيدة لتطبيقات qPCR لأنها تعزز ذوبان نسخ RNA-DNA المزدوجة أثناء الدورة الأولى من PCR.

تصميم التمهيدي

يجب تصميم بادئات PCR المستخدمة لخطوة qPCR في RT-qPCR بشكل مثالي لتمتد على تقاطع exon-exon ، حيث يمكن أن يمتد التمهيدي التضخيم على حدود exon-intron الفعلية.نظرًا لعدم تضخيم تسلسل الحمض النووي الجيني المحتوي على الإنترون ، فإن هذا التصميم يقلل من مخاطر الإيجابيات الكاذبة التي يتم تضخيمها من تلويث الحمض النووي الجيني.

إذا تعذر تصميم البادئات لفصل حدود exons أو exon-exon ، فقد يكون من الضروري معالجة عينات RNA باستخدام DNase I أو dsDNase الخالي من RNase لإزالة تلوث الحمض النووي الجيني.

التحكم RT-qPCR

يجب تضمين عنصر تحكم سلبي في النسخ العكسي (تحكم -RT) في جميع تجارب RT-qPCR للكشف عن تلوث الحمض النووي (مثل الحمض النووي الجيني أو منتجات PCR من التفاعلات السابقة).يحتوي عنصر التحكم هذا على جميع مكونات التفاعل باستثناء النسخ العكسي.نظرًا لأن النسخ العكسي لا يحدث مع هذا التحكم ، إذا لوحظ تضخيم PCR ، فمن المرجح أن يكون التلوث من الحمض النووي.