يعد التحقق من أداء البادئات والتحقيقات في المرحلة المبكرة من كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحديد ظروف التفاعل الأكثر ملاءمة من المتطلبات الأساسية لضمان التقدم السلس للتجارب الرسمية.
فكيف نحتاج إلى تأكيد المسبار التمهيدي في المرحلة المبكرة؟
المؤشرات الرئيسية هي خط الأساس ومنحنى التضخيم وقيمة ct وكفاءة التضخيم واكتشاف العينة منخفضة التركيز والسيرة الذاتية وما إلى ذلك.
حدود
الخط الأساسي هو الخط الأفقي في منحنى تضخيم PCR.في الدورات القليلة الأولى من تفاعل تضخيم PCR ، لا تتغير إشارة التألق كثيرًا وتشكل خطًا مستقيمًا.هذا الخط المستقيم هو خط الأساس.
عند فحص تحقيقات PCR التمهيدي ، انتبه إلى ما إذا كان خط الأساس مستويًا.سيؤثر نقاء تركيز المسبار التمهيدي على خط الأساس ، مثل التسبب في ارتفاع أو انخفاض خط الأساس.يعتبر خط الأساس أيضًا مؤشرًا بديهيًا للغاية.
منحنى التضخيم
مؤشر بديهي آخر هو شكل منحنى التضخيم.من الأفضل أن يكون لديك منحنى على شكل حرف S لتجنب التضخيم الثانوي أو منحنيات التضخيم غير الطبيعية الأخرى.
قيمة ط م
عدد الدورات المقابلة لنقطة الانعطاف من خط الأساس إلى النمو الأسي هو قيمة Ct.
بالنسبة للعينة نفسها ، ينتج عن تحقيقات التمهيدي المختلفة منحنيات تضخيم مختلفة ، وستتأثر قيمة Ct المقابلة بكفاءة التضخيم ودرجة التداخل.من الناحية النظرية ، كلما كانت قيمة Ct للمسبار التمهيدي الذي نختاره أصغر ، كان ذلك أفضل.
كفاءة التضخيم
يعد المنحنى القياسي أحد أكثر الطرق موثوقية واستقرارًا لتقييم كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو أيضًا معترف به على نطاق واسع من قبل الباحثين.تتضمن الطريقة عمل سلسلة من العينات للتحكم في العدد النسبي للقوالب المستهدفة.عادة ما يتم صنع هذه العينات عن طريق التخفيفات التسلسلية لمحاليل المخزون المركزة ، والأكثر استخدامًا هو تخفيف 10 أضعاف.باستخدام سلسلة من العينات المخففة ، باستخدام برنامج qPCR القياسي للتضخيم للحصول على قيمة Cq ، وأخيراً ارسم منحنى قياسيًا وفقًا لتركيز كل عينة وقيمة Cq المقابلة للحصول على المعادلة الخطية Cq = -klgX0 + b ، وكفاءة التضخيم E = 10 (-1 / k) -1.عند استخدام qPCR للتحليل الكمي ، يجب أن تكون كفاءة التضخيم في حدود 90٪ -110٪ (3.6> k> 3.1).
كشف العينات منخفضة التركيز
عندما يكون تركيز العينة منخفضًا ، تختلف معدلات الكشف عن مجسات التمهيدي المختلفة.نختار 20 عينة منخفضة التركيز لنسخها ، ونظام المسبار التمهيدي ذو أعلى معدل اكتشاف هو الأفضل.
معامل التباين (CV)
يمكن الكشف عن 10 عينات مكررة باستخدام مجسات أولية مختلفة وفقًا لمعيار خط الكاشف للكشف عن تضخيم الحمض النووي.
الكواشف الكمية:
دقة
يجب أن تتوافق الدقة داخل دفعة واحدة: معامل الاختلاف (CV ،٪) للقيمة اللوغاريتمية لتركيز الاختبار هو ≤5٪.عندما يكون تركيز العينة منخفضًا ، يكون معامل الاختلاف (CV ،٪) للوغاريتم لتركيز الكشف ≤10٪
الكواشف النوعية:
دقة
يجب أن تتوافق الدقة في الدفعة الواحدة مع:
(1) معامل الاختلاف في قيمة Ct (CV ،٪) ≤5٪
يتم اختبار نفس العينة بالتوازي لمدة 10 مرات ، ويجب أن تكون نتائج الاختبار متسقة
الوقت ما بعد: 18 سبتمبر - 2021
