أعتقد أن كل شخص سيواجه دائمًا مثل هذه المشكلات أو تلك عند إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ولكن يمكن تصنيف معظمها إلى مشكلتين رئيسيتين:

تضخيم ضئيل جدًا لقالب الجين (التضخيم) ؛
الكثير من تضخيم الجينات غير المستهدف.
يعد استخدام المواد المضافة إحدى الاستراتيجيات الشائعة لحل هذه المشكلات.عادة ما يكون لدور المواد المضافة جانبان:
الهيكل الثانويالجينات (البنية الثانوية) ؛
تقليل فتيلة غير محددة.
اليوم ، سيقدم لك المحرر بإيجاز الإضافات الشائعة في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ووظائفها.
إضافات تقلل من الهيكل الثانوي
سلفوكسيد(DMSO)
عينات الجيناتمع نسبة عالية من GC.ومع ذلك ، فإن DMSO يقلل بشكل كبير من نشاط بوليميريز Taq.لذلك ، يجب على الجميع تحقيق التوازن بين إمكانية الوصول إلى القالب ونشاط البوليميراز.يقترح المحرر أنه يمكنك تجربة تركيزات مختلفة من DSMO ، مثل 2٪ إلى 10٪ ، للعثور على التركيز الذي يناسب تجربتك.
منظفات غير أيونية
عادةً ما تقلل المنظفات غير الأيونية ، مثل 0.1-1٪ Triton X-100 أو Tween 20 أو NP-40 ، البنية الثانوية للحمض النووي.على الرغم من أن هذا يمكن أن يزيد من تضخيم جين القالب ، إلا أنه سيؤدي أيضًا إلى مشكلة التضخيم غير المحدد.لذلك ، تعمل هذه الإضافات بشكل جيد مع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل منخفضة العائد بدون حطام ، ولكن ليس جيدًا لتفاعلات PRC غير النقية نسبيًا.فائدة أخرى للمنظفات غير الأيونية هي الحد من تلوث SDS.عادة أثناء عملية استخراج الحمض النووي ، سيتم إحضار SDS إلى خطوة PCR ، والتي تثبط بشكل كبير نشاط البوليميراز.لذلك ، فإن إضافة 0.5٪ Tween-20 أو Tween-40 إلى التفاعل يمكن أن يحيد الآثار السلبية لـ SDS.
البيتين_
يمكن للبيتين تحسين تضخيم الحمض النووي عن طريق تقليل تكوين البنية الثانوية وهو بشكل عام إضافة "لغز" لمجموعات PCR التجارية.إذا كنت ترغب في استخدام البيتين ، يجب عليك وضع البيتين أو البيتين أحادي الهيدرات (البيتين أو البيتين أحادي الهيدرات) ، ولكن ليس البيتين هيدروكلوريد (البيتين هيدروكلوريد) ، والتكيف مع التركيز النهائي من 1-1.7 مليون.يمكن أن يساعد البيتين أيضًا في تحسين الخصوصية لأنه يزيل اعتماد تكوين الزوج الأساسي على ذوبان الحمض النووي / تمسخ الحمض النووي.
إضافات لتقليل فتيلة غير محددة
فورماميد
Formamide هو مادة مضافة عضوية PCR شائعة الاستخدام.يمكن أن تتحد مع الأخدود الرئيسي والأخدود البسيط في الحمض النووي ، وبالتالي تقليل استقرار الحلزون المزدوج الرئيسي للحمض النووي وتقليل درجة حرارة انصهار الحمض النووي.عادة ما يكون تركيز فورماميد المستخدم في تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل 1٪ -5٪.
رباعي ميثيلكلوريد الأمونيوم( TMAC)
يمكن أن يزيد كلوريد رباعي ميثيل الأمونيوم من خصوصية التهجين (خصوصية التهجين) ويزيد درجة حرارة انصهار الحمض النووي.وبالتالي ، يمكن لـ TMAC إزالة فتيلة غير محددة وتقليل الربط الخاطئ للحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي.إذا كنت تستخدمالاشعال المتدهورةفي تفاعل PCR ، تذكر إضافة TMAC ، والذي يشيع استخدامه بتركيز 15-100mM.
المضافات الشائعة الأخرى
بالإضافة إلى فئتي الإضافات المذكورتين أعلاه ، هناك العديد من الإضافات الشائعة في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على الرغم من أن لها وظائف مختلفة ، إلا أنها مهمة جدًا أيضًا.
أيون المغنيسيوم
أيون المغنيسيوم هو عامل مساعد لا غنى عنه (عامل مساعد) للبوليميراز ، أي أنه بدون أيون المغنيسيوم ، يكون البوليميراز غير نشط.ومع ذلك ، يمكن أن يؤثر الكثير من أيونات المغنيسيوم أيضًا على كفاءة البوليميراز.سيختلف تركيز أيونات المغنيسيوم في كل تفاعل PCR.العوامل المخلبية (مثل EDTA أو السترات) وتركيز dNTPs والبروتينات كلها تؤثر على تركيز أيونات المغنيسيوم.لذلك ، إذا كانت لديك مشاكل مع تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيمكنك محاولة تغيير تركيزات أيونات المغنيسيوم المختلفة ، على سبيل المثال ، من 1.0 إلى 4.0 ملي مولار ، بفاصل 0.5-1 ملي مولار بينهما.
تجدر الإشارة إلى أن دورات التجميد والذوبان المتعددة يمكن أن تؤدي إلى طبقات تركيز لمحلول كلوريد المغنيسيوم.لذلك يجب إذابته تمامًا قبل كل استخدام ، وخلطه جيدًا قبل استخدامه.
الزلال المصل البقري(الزلال البقري ، BSA)
في تجارب الكيمياء الجزيئية ، يعتبر ألبومين المصل البقري مادة مضافة شائعة جدًا ، لا سيما في تجارب هضم إنزيم التقييد وتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل.في تفاعلات PCR ، يكون BSA مفيدًا في تقليل الملوثات مثل المركبات الفينولية.ويقال أيضًا أنه يمكن أن يقلل من التصاق المواد المتفاعلة بجدار أنبوب الاختبار.في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، عادة ما يصل تركيز مساحة سطح الجسم المضافة إلى 0.8 مجم / مل.
 
منتجات ذات صله:
البطل PCR(مع صبغ)
البطل PCR