تفاعل PCR المباشر هو تفاعل يستخدم الأنسجة الحيوانية أو النباتية بشكل مباشر للتضخيم دون استخراج الحمض النووي.من نواح كثيرة ، يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي

الاختلاف الرئيسي هو المخزن المؤقت المخصص المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر ، يمكن أن تتعرض العينة مباشرة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل دون استخراج الحمض النووي ، ولكن هناك متطلبات مقابلة لتحمل الإنزيمات وتوافق المخزن المؤقت المتضمن في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر.

على الرغم من وجود مثبطات PCR أكثر أو أقل في العينات الشائعة ، لا يزال بإمكان PCR المباشر تحقيق تضخيم موثوق به تحت تأثير الإنزيمات والمخازن المؤقتة.يتطلب تفاعل PCR التقليدي حمضًا نوويًا عالي الجودة كقالب ، والذي يمكن أن يمنع التقدم السلس لتفاعل PCR إذا كان القالب يحتوي على بروتينات وشوائب أخرى.يعد Direct PCR حاليًا أحد أكثر التقنيات شيوعًا في مجال التشخيص الجزيئي.

01 تم استخدام PCR المباشر في الأصل للحيوانات والنباتات

أقرب تطبيق لـ PCR المباشر هو في مجال الحيوانات والنباتات ، مثل الدم والأنسجة والشعر من الفئران والقطط والدجاج والأرانب والأغنام والماشية وما إلى ذلك ، وأوراق النبات والبذور ، وما إلى ذلك ، وتستخدم لدراسة التنميط الجيني ، والجينات المعدلة وراثيا ، والكشف عن البلازميد ، وتحليل خروج المغلوب للجينات ، وتحديد مصدر الحمض النووي ، وتحديد الأنواع ، وتحليل SNP وغيرها من المجالات.

تحتوي هذه الحقول على بعض الميزات المشتركة ، أي أن محتوى الجين المستهدف مرتفع نسبيًا واستخراج الحمض النووي أمر مزعج ، لذلك لا يمكن لـ PCR المباشر فقط توفير الوقت ويكون له تأثير ضئيل على النتائج ، ولكن أيضًا يوفر التكلفة.

تعد عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر المستخدمة في اكتشاف العوامل الممرضة مسألة السنوات الأخيرة ، وقد بذل بعض مصنعي كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكثير من الجهود في هذا الاتجاه عند إجراء الابتكار.خاصة في وباء COVID-19 هذا ، ظهرت العديد من منتجات الكشف هذه في السوق ، مثل SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) التي تم بحثها وتطويرها بواسطة Foregene ، والتي تستخدم تقنية RT PCR في الوقت الحقيقي (rRT-PCR) للكشف النوعي عن عينات SARS-CoV-2 أو الحمض النووي البشري.

Foregene هي إحدى الشركات التي تستخدم تقنية Direct PCR للكشف عن ORF1ab و N و E والبديل سلالات الأحماض النووية في عينات مسحة بلعومية بشرية أو فم بلعومي مثل SARS-CoV-2 B.1.1.7 سلالة (المملكة المتحدة) ، سلالة B.1.351 (ZA) ، نسب B.1.617 (IND) ونسب P.1 (BR).

02  الكواشف اللازمة لتفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر

عينة Lysate

يمكن تكوين العينة المحللة بنفسك أو شراؤها.سيجعل الاختلاف في تكوين ماركات مختلفة من lysate قدرة lysing مختلفة ، وبعد ذلك سيكون وقت lysing مختلفًا قليلاً.على سبيل المثال ، لتحضير عينات الأنسجة الحيوانية ، يوصى عمومًا بالتحليل لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل ، ويتراوح محلول تحلل الفيروسات من 3 إلى 10 دقائق.

مزيج رئيسي PCR

من المستحسن استخدام بوليميراز DNA للبدأ الساخن لتعزيز التضخيم المحدد وزيادة قدرة التضخيم.جوهر PCR المباشر هو بوليميريز عالي التحمل.

القضاء على أو تثبيط المكونات في العينة التي تؤثر على تضخيم الحمض النووي

بعد معالجة العينة بالمحلول ، سيتم إطلاق البروتينات والدهون وغيرها من حطام الخلية ، ستثبط هذه المواد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.لذلك ، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر إضافة إزالة أو مثبطات مقابلة لتقليل تأثير هذه العوامل.

03  مجموعة من خمس نقاط معرفية مباشرة PCR

أولاً ، تقنية Direct PCR هي تقنية PCR مباشرة لعينات بيولوجية مختلفة.في ظل هذه الحالة الفنية ، ليست هناك حاجة لفصل واستخراج الحمض النووي ، واستخدام عينة الأنسجة مباشرة ككائن ، وإضافة بادئات الجين المستهدفة لإجراء تفاعل PCR.

ثانيًا ، تقنية Direct PCR ليست مجرد تقنية تقليدية لتضخيم قالب الحمض النووي ، ولكنها تتضمن أيضًا نسخًا عكسيًا لقالب الحمض النووي الريبي PCR.

ثالثًا ، لا تقوم تقنية Direct PCR فقط بإجراء تفاعلات PCR نوعية روتينية على عينات الأنسجة فحسب ، بل تشمل أيضًا تفاعلات qPCR في الوقت الفعلي ، والتي تتطلب أن يكون لنظام التفاعل قدرة قوية على التداخل الفلوري المضاد للخلفية وإخماد التألق الداخلي القدرة العدائية.

رابعًا ، لا تحتاج العينات المستهدفة بواسطة تقنية Direct PCR إلا إلى إطلاق قوالب الحمض النووي ، ولا تزيل البروتينات ، والسكريات ، وأيونات الملح ، وما إلى ذلك ، التي تتداخل مع تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.الأمر الذي يتطلب أن يكون بوليميراز الحمض النووي و PCR Mix في نظام التفاعل يتمتعان بمقاومة ممتازة وقدرة على التكيف لضمان نشاط الإنزيم ودقة النسخ المتماثل في ظل الظروف المعقدة.

خامسًا ، عينة الأنسجة المستهدفة بواسطة تقنية Direct PCR بدون أي معالجة لتخصيب الحمض النووي وكمية القالب صغيرة جدًا ، مما يتطلب أن يكون لنظام التفاعل حساسية عالية للغاية وكفاءة تضخيم.