في تجارب qPCR ، يعد التصميم التمهيدي أيضًا رابطًا مهمًا جدًا.ما إذا كانت البادئات مناسبة أم لا ترتبط ارتباطًا وثيقًا بما إذا كانت كفاءة التضخيم تصل إلى المعيار ، وما إذا كانت المنتجات المكبرة محددة ، وما إذا كانت النتائج التجريبية متاحة.
فكيف تجعل خصوصية qPCR التمهيدي أفضل؟كفاءة تضخيم عالية؟
اليوم ، سنأخذك لتصميم بادئات qPCR معًا ، ونترك تصميم qPCR التمهيدي يصبح مهارة علمية فعالة في التجارب.
عند تصميم بادئات qPCR ، يجب عادةً الانتباه إلى النقاط التالية: يجب تصميم الاشعال عبر الإنترونات قدر الإمكان ، ويجب أن يكون طول المنتج 100-300 نقطة أساس ، ويجب أن تكون قيمة Tm قريبة قدر الإمكان من 60 درجة مئوية ، ويجب أن تكون البادئات الأولية والنهائية قريبة قدر الإمكان ، ويجب أن تكون نهاية التمهيدي G أو C ، إلخ. انتظر.
1. تصميم البادئات التي تغطي الإنترونات
عند تصميم بادئات qPCR ، فإن اختيار البادئات المصممة عبر الإنترونات يمكن أن يمنع تضخيم قالب جدنا ، وجميع المنتجات مشتقة من تضخيم (كدنا) ، وبالتالي القضاء على تأثير تلوث جدنا.
2. طول التمهيدي
يتراوح طول التمهيدي بشكل عام بين 18-30 nt ، ويجب التحكم في طول منتج التضخيم بين 100-300 bp قدر الإمكان.
إذا كان التمهيدي قصيرًا جدًا ، فسيؤدي ذلك إلى تضخيم غير محدد ، وإذا كان طويلًا جدًا ، فسيشكل بسهولة بنية ثانوية (مثل بنية دبوس الشعر).إذا كان منتج التضخيم طويلًا جدًا ، فهو غير مناسب لتفاعل البوليميراز ، مما سيؤثر على كفاءة تضخيم PCR.
3. محتوى GC وقيمة Tm
يجب التحكم في محتوى GC في البادئات بين 40٪ و 60٪.إذا كان مرتفعًا جدًا أو منخفضًا جدًا ، فلن يؤدي إلى بدء التفاعل.يجب أن يكون محتوى GC في البادئات الأمامية والخلفية قريبًا من نفس القيمة للحصول على نفس قيمة Tm ودرجة حرارة التلدين.
يجب أن تكون قيمة Tm بين 55-65 درجة مئوية قدر الإمكان ، وعمومًا حوالي 60 درجة مئوية ، ويجب أن تكون قيمة Tm من المنبع والمصب أقرب ما يمكن ، ويفضل ألا تزيد عن 4 درجات مئوية.
4. تجنب اختيار A في 3 نهاية التمهيدي
عندما تكون نهاية 3 من التمهيدي غير متطابقة ، فهناك اختلافات كبيرة في كفاءة التوليف للقواعد المختلفة.عندما تكون القاعدة الأخيرة هي A ، يمكنها أيضًا بدء توليف السلسلة حتى في حالة عدم التطابق ، وعندما تكون القاعدة الأخيرة هي T عندما ، تنخفض كفاءة تحريض عدم التطابق بشكل كبير.لذلك ، حاول تجنب اختيار A في نهاية 3 من التمهيدي ، ومن الأفضل اختيار T.
إذا كان مسبارًا تمهيديًا ، فلا يمكن أن تكون نهاية 5 للمسبار G ، لأنه حتى عندما تكون قاعدة G واحدة متصلة بمجموعة مراسل الفلورسنت FAM ، يمكن لـ G أيضًا إخماد إشارة الفلورسنت المنبعثة من مجموعة FAM ، مما يؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة.يظهر.
5. التوزيع الأساسي
يفضل أن يكون توزيع القواعد الأربعة في التمهيدي عشوائيًا ، مع تجنب أكثر من 3 G أو C متتالية عند الطرف 3 ، وأكثر من 3 متتاليةمن السهل إنشاء الاقتران G أو C في منطقة تسلسل GC-rich.
6. يجب أن تتجنب منطقة التصميم التمهيدي الهياكل الثانوية المعقدة.
سيؤثر الهيكل الثانوي الذي يتكون من الخيط الفردي لمنتج التضخيم على التقدم السلس لـ PCR.من خلال توقع وجود بنية ثانوية في التسلسل المستهدف مقدمًا ، حاول تجنب هذه المنطقة في تصميم البادئات.
7. يجب أن تحاول البادئات نفسها وبين البادئات تجنب القواعد التكميلية المتتالية.
لا يمكن أن يكون هناك 4 قواعد تكاملية متتالية بين البرايمر نفسه والبرايمر.لا ينبغي أن يحتوي التمهيدي نفسه على تسلسل تكميلي ، وإلا فإنه سوف يطوي نفسه لتشكيل بنية دبوس الشعر ، مما سيؤثر على مزيج التلدين من التمهيدي والقالب.
لا يمكن أن توجد التسلسلات التكميلية بين الاشعال المنبع والمصب.سيؤدي التكامل بين البادئات إلى إنتاج ثنائيات أولية ، مما يقلل من كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل ويؤثر حتى على الدقة الكمية.إذا كانت هياكل التمهيدي-dimer و hairpin لا يمكن تجنبها ، فيجب ألا تكون قيمة G عالية جدًا (يجب أن تكون أقل من 4.5 kcal / mol).
8. تعمل البادئات على تضخيم المنتج المحدد المستهدف.
الهدف النهائي لاكتشاف qPCR هو فهم وفرة الجين المستهدف.في حالة حدوث تضخيم غير محدد ، سيكون القياس الكمي غير دقيق.لذلك ، بعد تصميم البادئات ، يجب اختبارها بواسطة BLAST ، ومقارنة خصوصية المنتجات في قاعدة بيانات التسلسل.
بعد ذلك ، نأخذ الجين البشري GAS6 (توقف النمو المحدد 6) كمثال لتصميم بادئات qPCR.
01 الجينات الاستعلام
Homo GAS6من خلال NCBI.هنا ، يجب أن ننتبه إلى مقارنة اسم الجين والأنواع للتأكد من تناسقهما.
02 أوجد تسلسل الجينات
(1) إذا كان التسلسل المستهدف هو الحمض النووي الجيني ، فحدد التسلسل الأول ، وهو تسلسل الحمض النووي الجيني للجين.
(2) إذا كان التسلسل المستهدف هو mRNA ، فحدد التسلسل الثاني.بعد الدخول ، انقر فوق "CDS" في الجدول أدناه.تسلسل الخلفية البنية هو تسلسل ترميز الجين.
03 تصميمات أولية
أدخل واجهة Primer-BLAST
أدخل رقم التسلسل الجيني أو التسلسل بتنسيق Fasta في الجزء العلوي الأيسر ، وقم بتعبئة المعلمات ذات الصلة.

انقر فوق "الحصول على مواد أولية" وسيظهر NCBI ليخبرك أن اختيار المعلمة هذا سيتم تضخيمه إلى متغيرات الربط الأخرى.يمكننا التحقق من متغيرات الربط المختلفة وإرسالها للحصول على زوج التمهيدي المناسب (كما هو موضح في الشكل أدناه).قد تستغرق هذه العملية عشرات الثواني للتشغيل.
درجات حرارة التلدين لأزواج التمهيدي هذه كلها حوالي 60 درجة مئوية.وفقًا لغرض التجربة ، اختر مواد أولية بطول متوسط ​​وخصوصية جيدة وأقل تكاملًا ذاتيًا للبادئات للتجربة ، ومعدل النجاح مرتفع جدًا!
04 التحقق من خصوصية الأولي
في الواقع ، بالإضافة إلى تصميم البرايمر ، يمكن لـ Primer-Blast أيضًا تقييم البادئات التي صممناها بأنفسنا.ارجع إلى صفحة تصميم التمهيدي ، وأدخل البادئات الأولية والنهائية التي صممناها ، ولن يتم تعديل المعلمات الأخرى.بعد التقديم ، يمكنك معرفة ما إذا كان زوج البادئات موجودًا أيضًا في جينات أخرى.إذا تم عرضهم جميعًا على الجين الذي نريد تضخيمه ، مما يشير إلى أن خصوصية هذا الزوج من البادئات رائعة!(على سبيل المثال ، هذه هي النتيجة الوحيدة للاستعلام التمهيدي!)

05 حكم جودة التمهيدي
أي نوع من التمهيدي هو التمهيدي "المثالي" الذي يجمع بين "كفاءة التضخيم حتى المعيار" و "خصائص المنتج المكبرة" و "النتائج التجريبية الموثوقة"؟
كفاءة التضخيم

منحنى الانصهار
تصل كفاءة التضخيم للبادئات إلى 90٪ -110٪ ، مما يعني أن كفاءة التضخيم جيدة ، ومنحنى الذوبان له ذروة واحدة وعادة Tm> 80 ° C ، مما يعني أن خصوصية التضخيم جيدة.
 
منتجات ذات صله:
الوقت الحقيقي PCR Easy – SYBR GREEN I
الوقت الحقيقي PCR Easy-Taqman