تستخدم تقنية التشخيص الجزيئي طرق البيولوجيا الجزيئية لاكتشاف تعبير وهيكل المادة الوراثية لجسم الإنسان ومسببات الأمراض المختلفة ، وذلك لتحقيق الغرض من التنبؤ بالأمراض وتشخيصها.

في السنوات الأخيرة ، مع تحديث تكنولوجيا التشخيص الجزيئي وتكرارها ، أصبح التطبيق السريري للتشخيص الجزيئي أكثر شمولاً وعمقًا ، ودخل سوق التشخيص الجزيئي فترة من التطور السريع.

يلخص المؤلف تقنيات التشخيص الجزيئي الشائعة في السوق ، وينقسم إلى ثلاثة أجزاء: الجزء الأول يقدم تقنية PCR ، والجزء الثاني يقدم تقنية التضخيم الحراري للحمض النووي ، والجزء الثاني يقدم تقنية التسلسل.

01

الجزء الأول: تقنية PCR

تقنية PCR

PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل) هي إحدى تقنيات تضخيم الحمض النووي في المختبر ، ولها تاريخ لأكثر من 30 عامًا.

كانت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) رائدة في عام 1983 بواسطة كاري موليس من سيتوس ، الولايات المتحدة الأمريكية.تقدم موليس بطلب للحصول على براءة اختراع PCR في عام 1985 ونشر أول ورقة أكاديمية PCR عن العلوم في نفس العام.حصل موليس على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993.

المبادئ الأساسية لـ PCR

يمكن لـ PCR تضخيم شظايا الحمض النووي المستهدفة بأكثر من مليون مرة.المبدأ هو أنه في ظل تحفيز بوليميراز الحمض النووي ، يتم استخدام الحمض النووي الوالد كقالب ، ويستخدم التمهيدي المحدد كنقطة انطلاق للتمديد.يتم تكراره في المختبر من خلال خطوات مثل التمسخ والصلب والتمديد.عملية DNA جديلة ابنة مكملة لقالب جديلة الوالد DNA.

تنقسم عملية PCR القياسية إلى ثلاث خطوات:

1. تمسخ: استخدم درجة حرارة عالية لفصل خيوط الحمض النووي المزدوجة.تنكسر روابط الهيدروجين بين خيوط الحمض النووي المزدوجة عند درجات حرارة عالية (93-98 درجة مئوية).

2. التلدين: بعد فصل DNA مزدوج الشريطة ، تنخفض درجة الحرارة بحيث يمكن أن يرتبط التمهيدي بالحمض النووي أحادي السلسلة.

3. التمديد: يبدأ بوليميراز الدنا في تصنيع خيوط تكميلية على طول خيوط الدنا من البادئات المرتبطة عند خفض درجة الحرارة.عند اكتمال التمديد ، تكتمل الدورة ، ويتضاعف عدد شظايا الحمض النووي.

تردد هذه الخطوات الثلاث 25-35 مرة ، سيزداد عدد شظايا الحمض النووي أضعافا مضاعفة.

إن براعة PCR هي أنه يمكن تصميم بادئات مختلفة لجينات مستهدفة مختلفة ، بحيث يمكن تضخيم شظايا الجين المستهدفة في فترة زمنية قصيرة.

حتى الآن ، يمكن تقسيم PCR إلى ثلاث فئات ، وهي PCR العادي و PCR الكمي الفلوري و PCR الرقمي.

الجيل الأول من PCR العادي

استخدم أداة تضخيم PCR عادية لتضخيم الجين المستهدف ، ثم استخدم الاغاروز الكهربائي للهلام للكشف عن المنتج ، يمكن إجراء التحليل النوعي فقط.

العيوب الرئيسية للجيل الأول من PCR:

- عرضة للتضخيم غير النوعي والنتائج الإيجابية الخاطئة.

-الكشف يستغرق وقتا طويلا والعملية مرهقة.

- يمكن إجراء الاختبارات النوعية فقط.

الجيل الثاني من التألق الكمي PCR

يستخدم PCR الكمي الفلوري (Real-Time PCR) ، المعروف أيضًا باسم qPCR ، لمراقبة تراكم المنتجات المضخمة من خلال تراكم إشارات الفلورسنت عن طريق إضافة مجسات الفلورسنت التي يمكن أن تشير إلى تقدم نظام التفاعل ، وللحكم على النتائج من خلال منحنى التألق ، ويمكن قياسها كميًا بمساعدة قيمة Cq والمنحنى القياسي.

نظرًا لأن تقنية qPCR يتم تنفيذها في نظام مغلق ، يتم تقليل احتمالية التلوث ، ويمكن مراقبة إشارة التألق للكشف الكمي ، لذلك فهي الأكثر استخدامًا في الممارسة السريرية وأصبحت التكنولوجيا السائدة في PCR.

يمكن تقسيم المواد الفلورية المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي إلى: مجسات الفلورسنت TaqMan والمنارات الجزيئية والأصباغ الفلورية.

1) مسبار الفلورسنت TaqMan:

أثناء تضخيم PCR ، يضاف مسبار الفلورسنت المحدد أثناء إضافة زوج من الاشعال.المسبار عبارة عن قليل النوكليوتيد ، ويتم تمييز النهايتين على التوالي بمجموعة مراسلة الفلورسنت ومجموعة الفلورسنت المخمد.

عندما يكون المسبار سليمًا ، تمتص مجموعة التبريد إشارة الفلورسنت المنبعثة من مجموعة المراسلين ؛أثناء تضخيم PCR ، ينشق نشاط النيوكلياز الخارجي 5′-3 من إنزيم Taq ويحلل المسبار ، مما يجعل المجموعة الفلورية الخاصة بالمراسل والمُرَقِّي منفصلة عن المجموعة الفلورية ، بحيث يمكن لنظام مراقبة التألق استقبال إشارة التألق ، أي أنه في كل مرة يتم فيها تضخيم خيط DNA ، يتم تكوين جزيء الفلورسنت المتزامن مع PCR.

2) الأصباغ الفلورية SYBR:

في نظام تفاعل PCR ، تتم إضافة فائض من صبغة الفلورسنت SYBR.بعد أن يتم دمج صبغة الفلورسنت SYBR بشكل غير محدد في الشريط المزدوج للحمض النووي ، فإنها تصدر إشارة الفلورسنت.جزيء صبغة SYBR غير المدمج في السلسلة لن يصدر أي إشارة فلورية ، وبالتالي ضمان إشارة الفلورسنت الزيادة في منتجات PCR متزامنة تمامًا مع الزيادة في منتجات PCR.يرتبط SYBR فقط بالحمض النووي مزدوج السلسلة ، لذلك يمكن استخدام منحنى الذوبان لتحديد ما إذا كان تفاعل PCR محددًا.

3) منارات جزيئية

وهو عبارة عن مسبار مزدوج النوكليوتيد ذو حلقة جذعية يشكل بنية دبوس شعر من حوالي 8 قواعد في النهايتين 5 و 3.يتم إقران متواليات الحمض النووي في كلا الطرفين بشكل متكامل ، مما يتسبب في إحكام مجموعة الفلورسنت ومجموعة التبريد.أغلق ، لن ينتج الفلورة.

بعد إنشاء منتج PCR ، أثناء عملية التلدين ، يتم إقران الجزء الأوسط من المنارة الجزيئية بتسلسل DNA محدد ، ويتم فصل الجين الفلوري عن جين quencher لإنتاج الفلورة.

العيوب الرئيسية للجيل الثاني من PCR:

لا تزال الحساسية مفقودة ، والكشف عن العينات منخفضة النسخ غير دقيق.

هناك تأثير قيمة الخلفية ، والنتيجة عرضة للتدخل.

الجيل الثالث من PCR الرقمي

يحسب PCR الرقمي (DigitalPCR ، dPCR ، Dig-PCR) رقم نسخة التسلسل المستهدف من خلال اكتشاف نقطة النهاية ، ويمكنه إجراء الكشف الكمي المطلق الدقيق دون استخدام الضوابط الداخلية والمنحنيات القياسية.

يستخدم Digital PCR اكتشاف نقطة النهاية ولا يعتمد على قيمة Ct (عتبة الدورة) ، وبالتالي فإن تفاعل PCR الرقمي أقل تأثرًا بكفاءة التضخيم ، ويتم تحسين التسامح مع مثبطات تفاعل PCR ، بدقة عالية وإمكانية تكرار النتائج.

نظرًا لخصائص الحساسية العالية والدقة العالية ، لا تتدخل مثبطات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسهولة ، ويمكنها تحقيق التقدير الكمي المطلق الحقيقي بدون المنتجات القياسية ، والتي أصبحت نقطة ساخنة للبحث والتطبيق.

وفقًا للأشكال المختلفة لوحدة التفاعل ، يمكن تقسيمها إلى ثلاثة أنواع: أنظمة موائع جزيئية ، وشريحة ، وأنظمة قطيرة.