قيمة Ct هي أهم شكل من أشكال عرض النتائج في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري.يتم استخدامه لحساب اختلافات التعبير الجيني أو رقم نسخة الجينات.إذن ما هي قيمة Ct للتقدير الكمي للفلورة التي تعتبر معقولة؟كيف نضمن النطاق الفعال لقيمة Ct؟

ما هي قيمة Ct؟
أثناء عملية تضخيم qPCR ، العدد المقابل لدورات التضخيم (عتبة الدورة) عندما تصل إشارة التألق للمنتج المضخم إلى عتبة التألق المحددة.يشير C إلى Cycle و T يشير إلى Threshold.ببساطة ، قيمة Ct هي عدد الدورات المقابلة عندما يصل تضخيم القالب الأولي إلى كمية معينة من المنتج في qPCR.سيتم شرح ما يسمى بـ "كمية معينة من المنتج" لاحقًا.

ماذا تفعل قيمة Ct؟

1. العلاقة بين التضخيم الأسي ومقدار القالب وقيمة Ct
من الناحية المثالية ، تتراكم الجينات في qPCR عن طريق التضخيم الأسي بعد عدد معين من الدورات.العلاقة بين عدد دورات التضخيم وكمية المنتجات هي: كمية المنتج المضخم = كمية القالب الأولية × (1 + En) عدد الدورات.ومع ذلك ، فإن رد فعل qPCR ليس دائمًا في وضع مثالي.عندما تصل كمية المنتج المضخم إلى "كمية منتج معينة" ، يكون عدد الدورات في هذا الوقت هو قيمة Ct ، ويكون في فترة التضخيم الأسي.العلاقة بين قيمة Ct ومقدار قالب البداية: توجد علاقة خطية بين قيمة Ct للقالب ولوغاريتم رقم نسخة البداية للقالب.كلما زاد تركيز القالب الأولي ، قلت قيمة Ct ؛كلما انخفض تركيز القالب الأولي ، زادت قيمة Ct.

2.منحنى التضخيم ، عتبة التألق وكمية معينة من منتجات PCR
يتم تقديم كمية منتج تضخيم qPCR مباشرة في شكل إشارة الفلورسنت ، أي منحنى التضخيم.في المرحلة المبكرة من PCR ، يكون التضخيم في ظل ظروف مثالية ، وعدد الدورات صغير ، وتراكم المنتج صغير ، ولا يمكن تمييز مستوى التألق بوضوح عن الخلفية الفلورية.بعد ذلك ، يزداد التألق ويدخل المرحلة الأسية.يمكن اكتشاف كمية منتج PCR في نقطة معينة عندما يكون تفاعل PCR في المرحلة الأسية فقط ، والتي يمكن استخدامها كـ "كمية معينة من المنتج" ، ويمكن استنتاج المحتوى الأولي للقالب من هذا.لذلك ، فإن شدة إشارة التألق المقابلة لكمية معينة من المنتج هي عتبة التألق.

في المرحلة المتأخرة من PCR ، لم يعد منحنى التضخيم يظهر تضخيمًا أسيًا ، ويدخل المرحلة الخطية ومرحلة الهضبة.

3. استنساخ قيم Ct
عندما تصل دورة PCR إلى رقم دورة قيمة Ct ، فقد دخلت للتو فترة التضخيم الأسي الحقيقي.في هذا الوقت ، لم يتم تضخيم الخطأ الصغير ، وبالتالي فإن قابلية استنساخ قيمة Ct ممتازة ، أي أنه يتم تضخيم القالب نفسه في أوقات مختلفة أو في أنابيب مختلفة في نفس الوقت.التضخيم ، قيمة Ct التي تم الحصول عليها ثابتة.

1. كفاءة التضخيم En
تشير كفاءة تضخيم PCR إلى الكفاءة التي يحول بها البوليميراز الجين ليتم تضخيمه إلى amplicon.تكون كفاءة التضخيم عند تحويل جزيء DNA واحد إلى جزيئين DNA 100٪.يتم التعبير عن كفاءة التضخيم بشكل شائع كـ En.من أجل تسهيل تحليل المقالات اللاحقة ، يتم تقديم العوامل التي تؤثر على كفاءة التضخيم بإيجاز.

2- نطاق قيم Ct
تتراوح قيم Ct من 15 إلى 35.إذا كانت قيمة Ct أقل من 15 ، فيُعتبر أن التضخيم يقع ضمن نطاق فترة الأساس ولم يتم الوصول إلى عتبة التألق.من الناحية المثالية ، توجد علاقة خطية بين قيمة Ct ولوغاريتم رقم النسخة الأولية للقالب ، أي المنحنى القياسي.من خلال المنحنى القياسي ، عندما تكون كفاءة التضخيم 100٪ ، تكون قيمة Ct المحسوبة لتقدير رقم النسخة المفردة من الجين حوالي 35. إذا كانت أكبر من 35 ، فإن رقم النسخة الأولية للقالب نظريًا أقل من 1 ، والذي يمكن اعتباره بلا معنى.

بالنسبة لنطاقات Ct الجينية المختلفة ، نظرًا للاختلاف في عدد نسخ الجين وكفاءة التضخيم في مقدار القالب الأولي ، من الضروري عمل منحنى معياري للجين وحساب نطاق الكشف الخطي للجين.

3- العوامل المؤثرة في قيمة Ct
من العلاقة بين عدد دورات التضخيم وكمية المنتج: كمية المنتج المضخم = كمية القالب الأولي × (1 + En) رقم الدورة ، يمكن ملاحظة أنه في ظل الظروف المثالية ، سيكون لمقدار القالب الأولي و En تأثير سلبي على قيمة Ct.سيؤدي الاختلاف في جودة القالب أو كفاءة التضخيم إلى أن تكون قيمة Ct كبيرة جدًا أو صغيرة جدًا.

4.Ct القيمة كبيرة جدًا أو صغيرة جدًا