PCR هي تقنية تضخيم الحمض النووي الأكثر استخدامًا وتستخدم على نطاق واسع بسبب حساسيتها وخصوصياتها.ومع ذلك ، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل تمسخًا حراريًا متكررًا ولا يمكنه التخلص من قيود الاعتماد على الأدوات والمعدات ، مما يحد من تطبيقه في الاختبارات الميدانية السريرية.

منذ أوائل التسعينيات ، بدأت العديد من المختبرات في تطوير تقنية تضخيم درجة حرارة ثابتة لا تتطلب تمسخًا حراريًا.لقد طوروا الآن تقنية تضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة ، وتقنية تضخيم متساوي الحرارة لاستبدال حبلا ، وتقنية تضخيم متساوي الحرارة على شكل دائرة دائرية ، واعتماد تسلسل الحمض النووي.تكنولوجيا التضخيم متساوي الحرارة وغيرها من التقنيات. 

Lتضخيم متساوي الحرارة بوساطة oop

يعتمد مبدأ التضخيم على حقيقة أن الحمض النووي في حالة توازن ديناميكي عند حوالي 65 درجة مئوية.عندما يتم إقران أي أساس تمهيدي وتمديده إلى الجزء التكميلي من الحمض النووي المزدوج الشريطة ، فإن الخيط الآخر سوف ينفصل ويصبح منفردًا.

عند درجة الحرارة هذه ، يستخدم الحمض النووي 4 بادئات محددة للاعتماد على بوليميراز الحمض النووي المزاح في حبلا لإحداث دوران ذاتي لتوليف الحمض النووي المزاح بشكل مستمر.

حدد أولاً المناطق الست المحددة F3 و F2 و F1 و B1 و B2 و B3 على الجين المستهدف ، ثم صمم 4 بادئات بناءً على هذه المناطق الست المحددة (كما هو موضح في الشكل أدناه):

يتكون التمهيدي الداخلي الأمامي (FIP) من F1c و F2.

يتكون التمهيدي الداخلي الخلفي (BIP) من B1c و B2 ، ويستخدم TTTT كمباعد في المنتصف.

تتكون البادئات الخارجية F3 و B3 على التوالي من مناطق F3 و B3 على الجين المستهدف.

في نظام تفاعل LAMP ، يكون تركيز التمهيدي الداخلي عدة مرات من تركيز التمهيدي الخارجي.يتم دمج التمهيدي الداخلي أولاً مع خيط القالب لتكوين خيط تكميلي لتشكيل حبلا مزدوج للحمض النووي.بعد ذلك ، يتم دمج التمهيدي الخارجي مع حبلا القالب لتشكيل حبلا مزدوج للحمض النووي.تحت تأثير بوليميراز BstDNA ، يتم تحرير الخيط التكميلي المركب بواسطة التمهيدي الداخلي.بعد سلسلة من التفاعلات ، تشكل الخيط التكميلي أخيرًا خيطًا واحدًا من الحمض النووي بهيكل دمبل.

يتم استخدام خيط أحادي الحمض النووي لهيكل الدمبل كقالب لتكوين الحمض النووي لهيكل حلقة جذعية انتقالية بشكل مستمر بنهاية مفتوحة.تقوم البادئات الداخلية والخارجية بتوجيه الحمض النووي لهيكل الحلقة الجذعية الانتقالية للخضوع باستمرار لتفاعلات الإزاحة والتمديد ، وأخيراً تشكيل هياكل متعددة الحلقة الجذعية بأطوال مختلفة.خليط الحمض النووي.

مزايا وعيوب التضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة

مزايا المصباح:

(1) كفاءة تضخيم عالية ، والتي يمكن أن تضخم بشكل فعال 1-10 نسخ من الجين المستهدف في غضون ساعة واحدة ، وكفاءة التضخيم هي 10-100 مرة من PCR العادي.

(2) وقت رد الفعل قصير ، والخصوصية قوية ، ولا تتطلب معدات خاصة.

عيوب المصباح:

(1) متطلبات البادئات عالية بشكل خاص.

(2) لا يمكن استخدام المنتج المضخم للاستنساخ والتسلسل ، ولكن يمكن استخدامه فقط للحكم.

(3) نظرًا لحساسيته القوية ، فإنه من السهل تكوين الهباء ، مما يتسبب في نتائج إيجابية خاطئة ويؤثر على نتائج الاختبار.

Sتضخيم إزاحة التراند

تضخيم إزاحة الشريط (SDA) هو تقنية تضخيم للحمض النووي متساوي الحرارة في المختبر تعتمد على التفاعل الإنزيمي الذي اقترحه لأول مرة الباحث الأمريكي ووكر في عام 1992.

يشتمل النظام الأساسي لـ SDA على نوكلياز داخلي مقيد ، وبوليميراز DNA مع نشاط إزاحة حبلا ، وزوجين من البادئات ، و dNTPs ، وأيونات الكالسيوم والمغنيسيوم وأنظمة المخزن المؤقت.

يعتمد مبدأ تضخيم إزاحة الخيط على تسلسل التعرف على نوكلياز تقييد معدل كيميائيًا عند طرفي الحمض النووي المستهدف.يفتح نوكلياز داخلي فجوة في DNA الخيط في موقع التعرف الخاص به ، ويوسع بوليميراز الحمض النووي الفجوة 3 End ويستبدل خيط DNA التالي.

يمكن دمج خيوط الحمض النووي المفردة المستبدلة مع البادئات وتمديدها إلى خيوط مزدوجة بواسطة بوليميراز الحمض النووي.تتكرر هذه العملية باستمرار ، بحيث يتم تضخيم التسلسل المستهدف بكفاءة.

مزايا وعيوب تقنية تضخيم إزاحة حبلا

مزايا SDA:

كفاءة التضخيم عالية ، ووقت التفاعل قصير ، والخصوصية قوية ، ولا يلزم وجود معدات خاصة.

عيوب SDA:

المنتجات ليست موحدة ، وبعض المنتجات أحادية السلسلة ومزدوجة تقطعت بهم السبل يتم إنتاجها دائمًا في دورة SDA ، وسيحدث الذيل حتمًا عند اكتشافه بواسطة الرحلان الكهربائي.

Rتضخيم دائرة أولينج

يُقترح تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA) من خلال الاعتماد على طريقة نسخ الحمض النووي من الكائنات المسببة للأمراض عن طريق الدائرة المتدحرجة.يشير إلى استخدام الحمض النووي الدائري أحادي الجديلة كقالب عند درجة حرارة ثابتة ، وبوليميراز DNA خاص (مثل Phi29)) تحت تأثير تخليق DNA دائري الدائرة لتحقيق تضخيم الجين المستهدف.

يمكن تقسيم RCA إلى تضخيم خطي وتضخيم أسي.يمكن أن تصل كفاءة RCA الخطية إلى 10⁵مرات ، ويمكن أن تصل كفاءة RCA الأسي إلى 10⁹مرات.

تمييز بسيط ، كما هو موضح في الشكل أدناه ، يستخدم التضخيم الخطي فقط 1 تمهيدي ، والتضخيم الأسي ب يحتوي على 2 بادئات.

يسمى الخطي RCA أيضًا التمهيدي الفردي RCA.يرتبط التمهيدي بالحمض النووي الدائري ويمتد بفعل بوليميريز الحمض النووي.المنتج عبارة عن حبلا خطي واحد يحتوي على عدد كبير من المتواليات المتكررة آلاف المرات من طول الحلقة المفردة.

نظرًا لأن منتج RCA الخطي متصل دائمًا بالبادئ التمهيدي ، فإن التثبيت السهل للإشارة يعد ميزة رئيسية.

RCA الأسي ، المعروف أيضًا باسم التضخيم المتفرّع HRCA (Hyper المتفرعة RCA) ، في RCA الأسي ، يقوم أحد التمهيدي بتضخيم منتج RCA ، ويتم تهجين التمهيدي الثاني مع منتج RCA ويمتد ، والاستبدال مرتبط بالفعل بمنتج RCA.

مزايا وعيوب دائرة التدحرج لتضخيم الحمض النووي

مزايا RCA:

حساسية عالية ونوعية جيدة وعملية سهلة.

عيوب RCA:

مشاكل الخلفية أثناء الكشف عن الإشارة.أثناء تفاعل RCA ، قد يولد مسبار القفل غير المتداول وحمض DNA أو RNA للمسبار غير المنضم بعض إشارات الخلفية. 

Nالتضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي

التضخيم المستند إلى تسلسل الحمض النووي (NASBA) هو تقنية جديدة تم تطويرها على أساس PCR.إنه تضخيم مستمر ومتساوي للحمض النووي يسترشد بزوج من البادئات مع تسلسل محفز T7.يمكن للتقنية تضخيم نموذج RNA بحوالي 109 مرات في حوالي ساعتين ، وهو أعلى 1000 مرة من طريقة PCR التقليدية ولا تتطلب معدات خاصة.

تم استخدام هذه التقنية للتشخيص السريع للأمراض بمجرد ظهورها ، وتستخدم العديد من الشركات حاليًا هذه الطريقة في مجموعات الكشف عن الحمض النووي الريبي.

على الرغم من أن تضخيم الحمض النووي الريبي يمكن أن يستخدم أيضًا تقنية النسخ العكسي PCR ، إلا أن NASBA لها مزاياها الخاصة: يمكن تنفيذها في ظل ظروف درجة حرارة ثابتة نسبيًا ، وهي أكثر استقرارًا ودقة من تقنية PCR التقليدية.

يكون التفاعل عند 41 درجة مئوية ويتطلب AMV (فيروس أرومات نخاع العظم للطيور) النسخ العكسي ، RNase H ، T7 RNA polymerase وزوج من البادئات لإكماله.

تتضمن العملية بشكل أساسي:

يحتوي التمهيدي الأمامي على التسلسل التكميلي لمروج T7.أثناء التفاعل ، يرتبط التمهيدي الأمامي بخيط RNA ويتم تحفيزه بواسطة إنزيم AMV لتشكيل حبلا مزدوج من DNA-RNA.

RNase H يهضم الحمض النووي الريبي في الخيط المزدوج الهجين ويحتفظ بالحمض النووي أحادي الجديلة.

تحت تأثير التمهيدي العكسي وإنزيم AMV ، يتم تشكيل خيط مزدوج من الحمض النووي يحتوي على تسلسل محفز T7.

تحت تأثير T7 RNA polymerase ، تكتمل عملية النسخ ويتم إنتاج كمية كبيرة من RNA الهدف.

مزايا NASBA:

(1) يحتوي التمهيدي الخاص به على تسلسل محفز T7 ، لكن الحمض النووي الأجنبي مزدوج الشريطة لا يحتوي على تسلسل محفز T7 ولا يمكن تضخيمه ، لذلك تتمتع هذه التقنية بدرجة عالية من الخصوصية والحساسية.

(2) تدمج NASBA مباشرة عملية النسخ العكسي في تفاعل التضخيم ، مما يؤدي إلى تقصير وقت رد الفعل.

عيوب NASBA:

(1) مكونات التفاعل أكثر تعقيدًا.

(2) هناك حاجة لثلاثة أنواع من الإنزيمات لزيادة تكلفة التفاعل.