PCR, عديد PCR, في الموقع PCR, عكس PCR, RT-PCR, qPCR （1）-PCR

سنقوم بفرز المفاهيم والخطوات والتفاصيل الخاصة بمختلف PCR

Ⅰ. PCR

تفاعل البوليميراز المتسلسل ، المشار إليه باسم PCR ، هو تقنية بيولوجية جزيئية تُستخدم لتكبير أجزاء معينة من الحمض النووي.يمكن اعتباره تكرارًا خاصًا للحمض النووي في المختبر.تم اكتشاف بوليميراز الحمض النووي (DNA Polymerase I) في وقت مبكر من عام 1955 ، وتم اكتشاف جزء Klenow من E. Coli ، والذي له قيمة تجريبية وعملية ، من قبل الدكتور H.تم عزل الإنزيمات المستخدمة اليوم (تسمى Taq polymerase) من Thermus aquaticus ، وهي بكتيريا الينابيع الساخنة في عام 1976. وتتمثل خصائصها في قدرتها على مقاومة درجات الحرارة المرتفعة وهي إنزيم مثالي ، ولكنها تستخدم على نطاق واسع بعد الثمانينيات.المفهوم الأصلي للنموذج البدائي الأصلي لـ PCR مشابه لإصلاح الجينات والنسخ ، الذي اقترحه الدكتور KJell Kleppe في عام 1971. نشر أول نسخة جينية بسيطة وقصيرة المدى (على غرار أول دورتين من تفاعلات PCR).تم تطوير PCR اليوم بواسطة الدكتور Kary B. Mullis في عام 1983. خدم الدكتور Mullis شركات PE في ذلك العام ، لذلك تتمتع PE مكانة خاصة في صناعة PCR.نشر الدكتور موليس رسميًا أول ورقة بحثية ذات صلة مع Saiki وآخرين في عام 1985. ومنذ ذلك الحين ، أصبح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل آلاف الأميال يوميًا ، ويمكن القول إن جودة الأوراق البحثية ذات الصلة تجعل العديد من طرق البحث الأخرى غير مستساغة.بعد ذلك ، تُستخدم تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع في البحث العلمي البيولوجي والتطبيقات السريرية ، لتصبح أهم تكنولوجيا لأبحاث البيولوجيا الجزيئية.كما فاز موليس بجائزة نوبل في الكيمياء عام 1993.

PCRمبدأ

يشبه المبدأ الأساسي لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل عملية النسخ الطبيعية للحمض النووي ، وتعتمد خصوصيتها على أوليغنوكليوتيد التمهيدي المكمّل لكلا طرفي التسلسل المستهدف.يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من ثلاث خطوات تفاعلية أساسية قابلة للتحلل - التلدين - الممتد: ①Degeneration DNA القالب: بعد تسخين القالب DNA إلى حوالي 93 درجة مئوية لفترة زمنية معينة ، حل DNA مزدوج السلسلة المكون من تضخيم PCR لقالب ترك الحمض النووي ، اجعله سلسلة واحدة بحيث يمكن دمجه مع التمهيدي للتحضير لتفاعل الجولة التالية.التلدين (المركب) لقالب الحمض النووي والبادئة: بعد تسخين القالب وتحويله إلى سلسلة واحدة ، تنخفض درجة الحرارة إلى حوالي 55 درجة مئوية.التسلسل التكميلي للطلاء التمهيدي وسلسلة مفردة للحمض النووي.③ امتداد التمهيدي: قالب الحمض النووي - يعتمد الربط التمهيدي على عمل بوليميريز TaqDNA ، مع dNTP كمواد خام للتفاعل.احتفظ بمبدأ النسخ المتماثل ، وقم بتجميع سلسلة نسخ جديدة شبه محجوزة تكمل سلسلة DNA النموذجية ، ويمكن أن تحصل العمليات الثلاث المتكررة من انحطاط التدهور - التلدين - التمديد على المزيد من "سلسلة النسخ شبه المحجوزة" ، وهذه السلسلة الجديدة متاحة مرة أخرى كن نموذجًا للدورة التالية.يستغرق الأمر من 2 إلى 4 دقائق لإكمال الحلقة ، ويمكن تضخيم الجين المستهدف عدة ملايين مرة في 2-3 ساعات.

معيارPCRنظام رد الفعل

خمسة عناصر من تفاعل PCR

هناك خمسة أنواع أساسية من المواد المتضمنة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهي مادة أولية ، وإنزيم ، و dNTP ، وقالب ، ومخزن مؤقت (Mg2 + مطلوب).[إجراء PCR]

تنقسم عملية PCR القياسية إلى ثلاث خطوات

1. تنكس الحمض النووي (90 درجة مئوية - 96 درجة مئوية): قوالب الحمض النووي ثنائية السلسلة تحت تأثير حراري ، تنكسر الروابط الهيدروجينية ، وتشكل الحمض النووي أحادي السلسلة.

2. التلدين (25 درجة مئوية -65 درجة مئوية): يتم تقليل درجة حرارة النظام ، ويتم دمج التمهيدي مع قالب الحمض النووي لتشكيل سلسلة مزدوجة محلية.

3. التمديد (70 -75 ℃): تحت تأثير إنزيم Taq (حوالي 72 درجة مئوية ، أفضل نشاط) ، يتم استخدام dNTP كمادة خام ، ويمتد من نهاية 5 ′ من التمهيدي 3 نهاية ، والتوليف والقالب يكمل كل منهما سلسلة DNA أخرى.

يتم تغيير طبيعة كل دورة وتصلبها وتمديدها ، مما يؤدي إلى مضاعفة محتوى الحمض النووي.في الوقت الحالي ، بسبب منطقة التضخيم القصيرة ، يمكن تكرار بعض PCR في وقت قصير جدًا حتى لو لم يكن نشاط إنزيم Taq هو الأمثل ، لذلك يمكن تغييره إلى خطوتين ، أي ، يمكن إجراء التلدين والتمديد عند 60 درجة مئوية -65 درجة مئوية في نفس الوقت.وذلك لتقليل عملية الرفع والتبريد وتحسين سرعة الاستجابة.

ميزات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل

● دقة عالية

العوامل الحاسمة المحددة لاستجابة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي: التركيبة المحددة من التمهيدي والقالب DNA.② مبدأ الاقتران الأساسي.③ ولاء تفاعل تخليق بوليميراز TaqDNA.خصوصية وتحفظ الجين المستهدف.

التركيبة الصحيحة من البادئات والقوالب هي المفتاح.يعتمد ربط التمهيدي والقالب وامتداد سلسلة التمهيدي على مبدأ مطابقة القاعدة القلوية.يمكن إجراء ولاء تفاعلات تخليق البوليميراز ومقاومة درجات الحرارة العالية لبوليميراز DNA Taq لعمل ارتباط (مركب) للقالب والتمهيدي في التفاعل عند درجة حرارة أعلى.يتم زيادة خصوصية المجموعة بشكل كبير.يمكن أن يحافظ المقطع على درجة عالية من الدقة.من خلال اختيار منطقة وراثية مستهدفة ذات درجة تحفظ عالية وتحفظ عالي ، تكون خصوصيتها أعلى.

● حساسية عالية

يتم زيادة حجم إنتاج منتجات PCR بواسطة الفهرس ، والذي يمكن أن يوسع نموذج البداية لـ Picker (PG = 10-12) لزيادة مستوى متحكم دقيق إلى مستوى ميكروغرام (ميكروغرام = -6).يمكن اكتشاف الخلايا المستهدفة من مليون خلية ؛في الكشف عن الفيروسات ، يمكن أن تصل حساسية PCR إلى 3 وحدات RFU (وحدات مكونة للبقع الفارغة) ؛الحد الأدنى لمعدل الكشف في علم البكتريا هو 3 بكتيريا.

● بسيطة وسريعة

يستخدم انعكاس تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بوليميراز DNA عالي الحرارة Taq ، والذي يضيف محلول التفاعل في وقت واحد ، أي تفاعل تنكس - صلب - تمديد على محلول تضخيم الحمض النووي ووعاء حمام مائي.بشكل عام ، يكتمل تفاعل التضخيم في غضون 2 إلى 4 ساعات.يتم تحليل المنتجات المعززة بشكل عام بواسطة السيف الكهربائي ، ولا يتعين عليها استخدام النظائر ، ولا تلوث إشعاعي ، وسهولة الترويج.

● نقاوة العينة منخفضة

ليست هناك حاجة لفصل الفيروسات أو البكتيريا والخلايا المزروعة.يمكن استخدام منتجات الحمض النووي الخام والحمض النووي الريبي كمضخمات.يمكن استخدام اكتشاف تضخيم الحمض النووي مباشرة باستخدام العينات السريرية مثل الدم وسوائل الجسم وسوائل غسيل السعال والشعر والخلايا والأنسجة الحية.

PCRمشاكل شائعة

● سلبي كاذب ، لا توجد نطاقات مضخمة

تتضمن المراحل الرئيسية لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ما يلي: تحضير قوالب الأحماض النووية ، جودة وخصوصية البادئات ، جودة الإنزيمات ظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل.يجب أيضًا تحليل ودراسة العثور على السبب للروابط أعلاه.

القوالب: ① القالب يحتوي على بروتين متنوع ، القالب يحتوي على مثبط إنزيم Taq ، لا يتم التخلص من البروتين الموجود في القالب ، وخاصة بروتين المجموعة في الكروموسوم.⑤ إن تنكس الحمض النووي لمزيل الألغام ليس شاملاً.عندما تكون جودة الإنزيمات والبادئات جيدة ، لا يوجد نطاق تضخيم ، وهو على الأرجح العلاج الهضمي للعينات.هناك خطأ ما في عملية استخلاص الحمض النووي النموذجي ، لذلك لإعداد محلول هضم فعال ومستقر ، يجب إصلاح إجراءاته وعدم تغييره بشكل تعسفي.

تثبيط الإنزيم: يجب استخدام إنزيم جديد أو كل من الإنزيمات القديمة والجديدة معًا لتحليل ما إذا كان نشاط الإنزيم مفقودًا أم غير كافٍ ، مما يؤدي إلى سلبيات خاطئة.وتجدر الإشارة إلى أن إنزيم طق أو بروميد إيثيديوم يُنسى أحيانًا.

التمهيدي: جودة التمهيدي ، وتركيزه ، وما إذا كان تركيز البادرين متماثلًا.إنه سبب شائع لفشل PCR أو أن النطاق المتزايد ليس مثاليًا وعرضة للانتشار.توجد مشاكل في جودة البادئات لبعض أرقام الدُفعات.يحتوي البادئين على تركيز عالٍ وتركيز منخفض ، مما يؤدي إلى تضخيم غير متماثل منخفض الكفاءة.الإجراءات المضادة هي: اختيار أساس جيد لتجميع الوحدات.② لا يعتمد تركيز البرايمر على قيمة OD فحسب ، بل يهتم أيضًا بالسائل الأصلي للطلاء التمهيدي لصنع رحلان آجار جلدي كهربائي.يجب أن تكون هناك منطقة شريط تمهيدي ، ويجب أن يكون سطوع البادئين متسقًا بشكل عام.قد يفشل الحزام ، PCR في هذا الوقت ، ويجب حله باستخدام وحدة تخليق التمهيدي.إذا كان الأساس التمهيدي مرتفعًا ، يكون السطوع منخفضًا ، ويجب موازنة تركيزه عند تخفيفه.③ يجب دفع تكلفة المادة الأولية وتخزينها بتركيز عالٍ لمنع التجميد المتعدد أو التبريد طويل الأمد للثلاجة ، مما يؤدي إلى تلف المادة الأولية وتلفها.تصميم التمهيدي غير معقول ، مثل طول التمهيدي غير كافٍ ، وتتكون الكتلة di بين البادئات.

تركيز Mg2 +: تركيز Mg2 + أيون له تأثير كبير على كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.يمكن أن يقلل التركيز المفرط من الجنس الآخر لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.إذا كان التركيز منخفضًا جدًا ، فإن إخراج تضخيم PCR سيؤدي إلى فشل تضخيم PCR بدون نطاق التمدد.

تغيير حجم التفاعل: الحجم المستخدم في تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل هو 20ul ، 30ul ، و 50ul أو 100uL ، يتم تعيين الحجم الكبير لتطبيق تضخيم PCR وفقًا للأغراض المختلفة للبحث العلمي والاختبار السريري.بعد عمل أحجام صغيرة مثل 20ul ، من الضروري إجراء حالة السلك عند عمل الحجم ، وإلا فسوف يفشل.

الأسباب المادية: التحول مهم جدا لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.إذا كانت درجة حرارة الانحطاط منخفضة ، فإن وقت الانحطاط قصير ، ومن المحتمل أن يحدث في صور سلبية كاذبة ؛يمكن أن تتسبب درجة حرارة التلدين المنخفضة جدًا في تضخيم غير محدد وتقليل كفاءة التضخيم المحددة.يؤثر بشكل كبير على مزيج من البادئات والقوالب لتقليل كفاءة تضخيم PCR.في بعض الأحيان يكون من الضروري استخدام موازين الحرارة القياسية لاكتشاف التباين والتليين ودرجة الحرارة الممتدة في الامتداد أو الطباخ القابل للذوبان في الماء ، وهو أحد أسباب فشل PCR.

متغيرات التسلسل المستهدف: في حالة حدوث تسلسل الهدف ، طفرة أو حذف ، الجمع بين النموذج الأولي والقالب ، أو بسبب عدم وجود تسلسل مستهدف ، سيفقد التمهيدي والقالب التسلسل التكميلي ، ولن ينجح تضخيم PCR الخاص به.

● إيجابية كاذبة

يظهر نطاق تضخيم PCR متسقًا مع نطاق التسلسل المستهدف ، وأحيانًا يكون نطاقه أكثر أناقة وأعلى.

تصميم التمهيدي غير مناسب: تسلسل التضخيم المحدد وتسلسل التضخيم غير الغرض لهما متماثل ، لذلك عند تضخيم PCR ، تكون منتجات PCR المضخمة عبارة عن تسلسلات غير هادفة.تسلسل الهدف قصير جدًا أو أن التمهيدي قصير جدًا ، وهو عرضة للإيجابية الخاطئة.تحتاج إلى إعادة تصميم.

التلوث المتقاطع للتسلسل المستهدف أو منتجات التضخيم: هناك سببان لهذا التلوث: الأول ، التلوث المتبادل للجينوم بأكمله أو الأجزاء الكبيرة ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.يمكن حل هذا النوع من النتائج الإيجابية الزائفة بالطرق التالية: كن حذرًا ولطيفًا أثناء التشغيل لمنع تسلسل الهدف من استنشاق مسدس العينة أو تناثره خارج أنبوب الطرد المركزي.باستثناء الإنزيمات والمواد التي لا تتحمل درجات الحرارة المرتفعة ، يجب تطهير جميع الكواشف أو المعدات بضغط عالٍ.يجب استخدام أنابيب وعينات الطرد المركزي في وقت واحد.عند الضرورة ، قبل إضافة العينات ، يتعرض أنبوب التفاعل والكاشف للأشعة فوق البنفسجية لتدمير الحمض النووي الموجود.ثانياً ، شظايا صغيرة في تلوث الهواء.هذه الأجزاء الصغيرة أقصر من التسلسل المستهدف ، لكن لها تماثل معين.يمكن تقسمها مع بعضها البعض.بعد استكمال البادئات ، يمكن توسيع منتج PCR ، مما يؤدي إلى إنتاج إيجابي خاطئ.يمكن استخدامه لتقليل أو القضاء على طريقة PCR العش.

● تظهر نطاق تضخيم غير محدد

النطاقات التي ظهرت بعد تضخيم PCR غير متوافقة مع الحجم المتوقع ، أو كبيرة أو صغيرة ، أو في نفس الوقت ، أو في نفس الوقت ، نطاقات تضخيم محددة ونطاقات تضخيم غير محددة.ظهور نطاقات غير محددة هو: أولاً ، البادئات غير مكتملة مكملة للتسلسل المستهدف ، أو بلمرة التمهيدي لتشكيل مجموعة di.والثاني هو أن تركيز أيونات MG2 + مرتفع للغاية ، ودرجة حرارة التلدين منخفضة للغاية ، وعدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتبط.ثانياً ، نوعية وكمية الإنزيمات.في كثير من الأحيان ، تكون إنزيمات بعض المصادر عرضة لنطاقات غير خاصة ولا تحدث إنزيمات المصدر الآخر.في بعض الأحيان يحدث تضخيم غير محدد للإنزيمات.الإجراءات المضادة هي: إعادة تصميم الجاذبية إذا لزم الأمر.قلل من كمية الإنزيم أو استبدل إنزيم مصدر آخر.قم بتقليل مقدار الأساسي ، وزيادة كمية القوالب بشكل مناسب ، وتقليل عدد الدورات.قم بزيادة درجة حرارة التلدين بشكل صحيح أو استخدم طريقة نقطتي درجة الحرارة (93 درجة مئوية تنكس ، تلدين وتمتد عند حوالي 65 درجة مئوية).

● اظهر شريط سحب غير مستقر أو شريط تشويه

يبدو أحيانًا أن تضخيم PCR يتم تطبيقه أو قصفه أو حزام يشبه السجاد.لهذا السبب ، نظرًا للكمية الزائدة من الإنزيمات أو الجودة الرديئة للإنزيم ، فإن تركيز dNTP مرتفع جدًا ، وتركيز Mg2 + مرتفع جدًا ، ودرجة حرارة التلدين منخفضة جدًا ، وعدد الدورات كثير جدًا.الإجراءات المضادة هي: تقليل كمية الإنزيمات ، أو تغيير إنزيم مصدر آخر.② تقليل تركيز dNTP تقليل تركيز Mg2 + بشكل صحيح.زيادة كمية القوالب وتقليل عدد الدورات.

منتجات ذات صله

PCR Heroᵀᴹ (مع صبغ)

دقة أعلى: 6 مرات أكثر من إنزيم طق العادي ؛

◮ سرعة تضخيم أسرع

◮ المزيد من القدرة على التكيف مع القالب

كفاءة تضخيم أعلى

◮ التحمل البيئي أقوى: يوضع عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع ، ويحافظ على أكثر من 90٪ من النشاط ؛

◮ له نشاط بوليميريز DNA 5 '→ 3' و 5 '→ 3' نشاط نوكلياز خارجي ، بدون نشاط نوكلياز خارجي 3 '→ 5'.

PCR Easyᵀᴹ (مع صبغ)

يجعل نظام التفاعل الفريد والبوليميراز عالي الكفاءة Taq DNA تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل يتمتع بكفاءة تضخيم أعلى وخصوصية وحساسية.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (خطوة واحدة) -SYBR Green I

◮ تقوم المجموعة المكونة من خطوة واحدة بإجراء النسخ العكسي وتفاعلات qPCR في نفس الأنبوب ، وتحتاج فقط إلى إضافة قالب RNA ، وأشعال PCR محددة و RNase-Free ddH₂O.

◮ يمكن للمجموعة أن تحلل بسرعة وكفاءة الحمض النووي الريبي الفيروسي أو تتبع الحمض النووي الريبي.

◮ تستخدم المجموعة كاشف النسخ العكسي الفريد Foregene و Foregene HotStar Taq DNA Polymerase جنبًا إلى جنب مع نظام تفاعل فريد لتحسين كفاءة التضخيم وخصوصية التفاعل بشكل فعال.

◮ يجعل نظام التفاعل المُحسَّن التفاعل يتمتع بحساسية كشف أعلى واستقرار حراري أقوى وتحمل أفضل.

◮ RT-qPCR سهل^TM(خطوة واحدة) - تأتي مجموعة SYBR Green I مع صبغة مرجعية داخلية ROX ، والتي يمكن استخدامها للتخلص من خلفية الإشارة وأخطاء الإشارة بين الآبار ، وهو أمر مناسب للعملاء لاستخدامها في نماذج مختلفة من أدوات PCR الكمية.

RT سهل^TMثانيًا (Master Premix لـ أول حبلا (كدنا) لتوليفالوقت الحقيقي PCR)

- قدرة فعالة على إزالة جدنا ، والتي يمكن أن تزيل جدنا في القالب في غضون دقيقتين.

-نظام نسخ عكسي فعال ، يستغرق 15 دقيقة فقط لإكمال توليف أول حبلا (كدنا).

- القوالب المعقدة: يمكن أيضًا عكس القوالب ذات المحتوى العالي من GC والبنية الثانوية المعقدة بكفاءة عالية.

-نظام النسخ العكسي عالي الحساسية ، يمكن للقوالب على مستوى pg أيضًا الحصول على cDNA عالي الجودة.

- يتمتع نظام النسخ العكسي باستقرار حراري عالي ، ودرجة حرارة التفاعل المثلى هي 42 درجة مئوية ، ولا يزال يتمتع بأداء نسخ عكسي جيد عند 50 درجة مئوية.