PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل) هي إحدى تقنيات تضخيم الحمض النووي في المختبر ، ولها تاريخ لأكثر من 30 عامًا.

كانت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل رائدة في تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل من قبل كاري موليس من سيتوس ، الولايات المتحدة الأمريكية في عام 1983. تقدم موليس بطلب للحصول على براءة اختراع تفاعل البوليميراز المتسلسل في عام 1985 ونشر أول ورقة أكاديمية PCR عن العلوم في نفس العام.حصل موليس على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993 عن عمله.

المبادئ الأساسية لـ PCR

يمكن لـ PCR تضخيم شظايا الحمض النووي المستهدفة بأكثر من مليون مرة.يخضع المبدأ لتحفيز بوليميراز الحمض النووي ، باستخدام DNA الخيط الأصلي كقالب وبادئ محدد كنقطة انطلاق للتمديد.يتم تكراره في المختبر من خلال خطوات مثل التمسخ والصلب والتمديد.عملية DNA جديلة ابنة مكملة لقالب جديلة الوالد DNA.

تنقسم عملية PCR القياسية إلى ثلاث خطوات:

1- التكاثر: استخدم درجة حرارة عالية لفصل خيوط الحمض النووي المزدوجة.يتم كسر رابطة الهيدروجين بين خيوط الحمض النووي المزدوجة عند درجة حرارة عالية (93-98 ℃).

2-التسوية: بعد فصل الحمض النووي مزدوج الشريطة ، قم بخفض درجة الحرارة بحيث يمكن أن يرتبط التمهيدي بالحمض النووي أحادي السلسلة.

3- الامتداد: يبدأ بوليميراز الدنا في تصنيع خيوط تكميلية على طول خيوط الدنا من البادئات المرتبطة عند خفض درجة الحرارة.عند اكتمال التمديد ، تكتمل الدورة ، ويتضاعف عدد شظايا الحمض النووي

تردد هذه الخطوات الثلاث 25-35 مرة ، سيزداد عدد شظايا الحمض النووي أضعافا مضاعفة.

إن براعة PCR هي أنه يمكن تصميم بادئات مختلفة لجينات مستهدفة مختلفة ، بحيث يمكن تضخيم شظايا الجين المستهدفة في فترة زمنية قصيرة.

حتى الآن ، يمكن تقسيم PCR إلى ثلاث فئات ، وهي PCR العادي و PCR الكمي الفلوري و PCR الرقمي.

الجيل الأول من PCR العادي

استخدم أداة تضخيم PCR عادية لتضخيم الجين المستهدف ، ثم استخدم الاغاروز الكهربائي للهلام للكشف عن المنتج ، يمكن إجراء التحليل النوعي فقط.

العيوب الرئيسية للجيل الأول من PCR:

1- عرضة للتضخيم غير النوعي والنتائج الإيجابية الخاطئة.

2-الكشف يستغرق وقتا طويلا والعملية مرهقة.

3- يمكن إجراء الاختبار النوعي فقط

الجيل الثاني في الوقت الحقيقي PCR

يستخدم PCR في الوقت الحقيقي ، المعروف أيضًا باسم qPCR ، مجسات الفلورسنت التي يمكن أن تشير إلى تقدم نظام التفاعل ، وتراقب تراكم المنتجات المضخمة من خلال تراكم إشارات الفلورسنت ، وتحكم على النتائج من خلال منحنى التألق.يمكن قياسه بمساعدة قيمة Cq والمنحنى القياسي.

نظرًا لأن تقنية qPCR يتم تنفيذها في نظام مغلق ، يتم تقليل احتمالية التلوث ، ويمكن مراقبة إشارة التألق للكشف الكمي ، لذلك فهي الأكثر استخدامًا في الممارسة السريرية وأصبحت التكنولوجيا السائدة في PCR.

يمكن تقسيم المواد الفلورية المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي إلى: مسبار TaqMan الفلوري ، والمنارات الجزيئية ، وصبغة الفلورسنت.

1) مسبار الفلورسنت TaqMan:

أثناء تضخيم PCR ، يضاف مسبار الفلورسنت المحدد أثناء إضافة زوج من التمهيدي.المسبار عبارة عن قليل النوكليوتيد ، ويتم تمييز كلا الطرفين بمجموعة مراسلة الفلورسنت ومجموعة الفلورسنت المخمد.

عندما يكون المسبار سليمًا ، تمتص مجموعة التبريد إشارة الفلورسنت المنبعثة من مجموعة المراسلين ؛أثناء تضخيم PCR ، ينشق نشاط النيوكلياز الخارجي 5′-3 من إنزيم Taq ويحلل المسبار ، مما يجعل المجموعة الفلورية الخاصة بالمراسل والمُرَقِّي منفصلة عن المجموعة الفلورية ، بحيث يمكن لنظام مراقبة التألق استقبال إشارة التألق ، أي أنه في كل مرة يتم فيها تضخيم خيط DNA ، يتم تكوين جزيء الفلورسنت المتزامن مع PCR.

2) صبغة الفلورسنت SYBR:

في نظام تفاعل PCR ، تتم إضافة فائض من صبغة الفلورسنت SYBR.بعد أن يتم دمج صبغة الفلورسنت SYBR بشكل غير محدد في الشريط المزدوج للحمض النووي ، فإنها تصدر إشارة الفلورسنت.جزيء صبغة SYBR غير المدمج في السلسلة لن يصدر أي إشارة فلورية ، وبالتالي ضمان إشارة الفلورسنت الزيادة في منتجات PCR متزامنة تمامًا مع الزيادة في منتجات PCR.يرتبط SYBR فقط بالحمض النووي مزدوج السلسلة ، لذلك يمكن استخدام منحنى الذوبان لتحديد ما إذا كان تفاعل PCR محددًا.

3) منارة الجزيئية:

وهو عبارة عن مسبار مزدوج النوكليوتيد ذو حلقة جذعية يشكل بنية دبوس شعر من حوالي 8 قواعد في النهايتين 5 و 3.يتم إقران متواليات الحمض النووي في كلا الطرفين بشكل متكامل ، مما يتسبب في إحكام مجموعة الفلورسنت ومجموعة التبريد.قريب ، لن يتم إنتاج أي مضان.

بعد إنشاء منتج PCR ، أثناء عملية التلدين ، يتم إقران الجزء الأوسط من المنارة الجزيئية بتسلسل DNA محدد ، ويتم فصل الجين الفلوري عن جين quencher لإنتاج الفلورة.

العيوب الرئيسية للجيل الثاني من PCR:

لا تزال الحساسية مفقودة ، واكتشاف العينات منخفضة النسخ غير دقيق.

هناك تأثير لقيمة الخلفية ، والنتيجة عرضة للتداخل.

عند وجود مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في نظام التفاعل ، تكون نتائج الكشف عرضة للتداخل.

الجيل الثالث من PCR الرقمي

يحسب PCR الرقمي (DigitalPCR ، dPCR ، Dig-PCR) رقم نسخة التسلسل المستهدف من خلال اكتشاف نقطة النهاية ، ويمكنه إجراء الكشف الكمي المطلق الدقيق دون استخدام الضوابط الداخلية والمنحنيات القياسية.

يستخدم Digital PCR اكتشاف النقطة النهائية ولا يعتمد على قيمة Ct (عتبة الدورة) ، وبالتالي فإن تفاعل PCR الرقمي أقل تأثرًا بكفاءة التضخيم ، ويتم تحسين التسامح مع مثبطات تفاعل PCR ، بدقة عالية وقابلية للتكرار.

نظرًا لخصائص الحساسية العالية والدقة العالية ، لا تتدخل مثبطات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسهولة ، ويمكنها تحقيق التقدير الكمي المطلق الحقيقي بدون المنتجات القياسية ، والتي أصبحت نقطة ساخنة للبحث والتطبيق.

وفقًا للأشكال المختلفة لوحدة التفاعل ، يمكن تقسيمها إلى ثلاثة أنواع رئيسية: أنظمة موائع جزيئية ، وأنظمة رقاقات وقطيرات.

1) ميكروفلويديك رقمي PCR ، mdPCR:

بناءً على تقنية ميكروفلويديك ، يتم فصل قالب الحمض النووي.يمكن لتقنية الموائع الدقيقة أن تدرك ترقية العينة بالنانو أو توليد قطرات أصغر ، لكن القطرات تحتاج إلى طريقة امتزاز خاصة ثم يتم دمجها مع نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.تم اعتماد mdPCR تدريجيًا عن طريق استبدال طرق أخرى.

2) PCR الرقمي المستند إلى القطرات ، ddPCR:

استخدم تقنية توليد قطرات الماء في الزيت لمعالجة العينة إلى قطرات ، وقسم نظام التفاعل الذي يحتوي على جزيئات الحمض النووي إلى آلاف القطيرات النانوية ، كل منها لا يحتوي على جزيء الحمض النووي المستهدف المراد اكتشافه ، أو يحتوي على واحد إلى عدة جزيئات مستهدفة من الحمض النووي ليتم اختبارها.

3) PCR الرقمي المستند إلى رقاقة ، cdPCR:

استخدم تقنية مسار السوائل المتكاملة لحفر العديد من الأنابيب الدقيقة والفراغات الدقيقة على رقائق السيليكون أو زجاج الكوارتز ، والتحكم في تدفق المحلول من خلال صمامات التحكم المختلفة ، وتقسيم سائل العينة إلى نانومترات من نفس الحجم في آبار التفاعل لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي لتحقيق القياس الكمي المطلق.

العيوب الرئيسية للجيل الثالث من PCR:

المعدات والكواشف باهظة الثمن.

متطلبات جودة النموذج عالية.إذا تجاوزت كمية القالب كمية النظام المصغر ، فسيكون من المستحيل تحديدها ، وإذا كانت صغيرة جدًا ، فسيتم تقليل دقة القياس الكمي.

يمكن أيضًا إنشاء إيجابيات كاذبة عندما يكون هناك تضخيم غير محدد.