COVID-19 هو مرض معد يسببه المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروس كورونا من النوع 2. عندما يصاب الشخص ، تشمل الأعراض الأكثر شيوعًا الحمى والسعال وضيق التنفس.

يمكن جمع العينات المستخدمة للاختبار عن طريق مسحات البلعوم أو مسحات البلعوم.

ما هو تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

الطريقة القياسية للكشف عن فيروس كورونا هي تفاعل البلمرة المتسلسل PCR.هذه طريقة مستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء الجزيئي.يمكنه بسرعة نسخ الملايين إلى المليارات من شظايا الحمض النووي المحددة.

يحتوي الفيروس التاجي الجديد على جينوم الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة طويل جدًا.من أجل اكتشاف هذه الفيروسات بواسطة PCR ، يجب تحويل جزيئات الحمض النووي الريبي إلى تسلسلات الحمض النووي التكميلية عن طريق النسخ العكسي ، ومن ثم يمكن تضخيم الحمض النووي المركب حديثًا عن طريق إجراءات PCR القياسية ، والتي تُعرف عادةً باسم RT-PCR.

عملية RT-PCR

استخراج الحمض النووي الريبي

لتنفيذ هذه الطريقة ، يجب استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي بشكل أساسي.يمكن استخدام مجموعة متنوعة من مجموعات تنقية الحمض النووي الريبي (RNA) للفصل المريح والسريع والفعال.

لاستخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام مجموعة تجارية ، قم أولاً بإضافة العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثم مزجه مع المخزن المؤقت للتحلل.يتم تغيير طبيعة هذا المخزن المؤقت بشكل كبير ويتكون عادة من الفينول وجوانيدين أيزوثيوسيانات.بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما تكون مثبطات RNase موجودة في المخزن المؤقت للتحلل لضمان عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي السليم.

بعد إضافة المخزن المؤقت للتحلل ، قم بتدوير أنبوب الخلط عن طريق النبض واحتضانه في درجة حرارة الغرفة.يتم بعد ذلك تحلل الفيروس في ظل ظروف شديدة التحلل التي يوفرها المخزن المؤقت للتحلل.

بعد سحب العينة ، يتم استخدام أنبوب طرد مركزي لإجراء التنقية.يتم تحميل العينة في أنبوب الطرد المركزي ثم طردها بالطرد المركزي.

هذا الإجراء عبارة عن طريقة استخلاص ذات مرحلة صلبة تتكون فيها المرحلة الثابتة من مصفوفة من هلام السيليكا.

في ظل ظروف الملح ودرجة الحموضة المثلى ، ترتبط جزيئات الحمض النووي الريبي بغشاء السيليكا.

في الوقت نفسه ، يتم إزالة البروتين والملوثات الأخرى.

بعد الطرد المركزي ، ضع أنبوب الطرد المركزي في أنبوب تجميع نظيف ، وتخلص من المرشح ، ثم أضف المخزن المؤقت للغسيل.

ضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لإجبار المخزن المؤقت للغسيل عبر الغشاء.سيؤدي ذلك إلى إزالة جميع الشوائب المتبقية من الغشاء ، تاركًا فقط الحمض النووي الريبي المرتبط بهلام السيليكا.

بعد غسل العينة ، ضع الأنبوب في أنبوب الطرد المركزي الدقيق النظيف وأضف المخزن المؤقت للشطف.

ثم يتم الطرد المركزي لإجبار المخزن المؤقت للشطف من خلال الغشاء.يزيل عازل الشطف الحمض النووي الريبي الفيروسي من عمود الدوران ويحصل على الحمض النووي الريبي المنقى الخالي من البروتينات والمثبطات والملوثات الأخرى.

الخطوة 2

تركيز مختلط

بعد استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي ، فإن الخطوة التالية هي تحضير خليط التفاعل لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.في هذه الخطوة ، يتم استخدام التركيز.هذا المحلول المركز عبارة عن محلول مركّز ممزوج مسبقًا يتكون من مزيج مسبق ، ونسخة عكسية ، ونيوكليوتيدات ، وبادئ أمامي ، وبادئ عكسي ، ومسبار TaqMan ، وبوليميراز DNA.

أخيرًا ، لإكمال خليط التفاعل هذا ، يتم إضافة قالب RNA.يتم خلط الأنابيب بالدوامة النبضية ، ثم يتم تحميل خليط التفاعل في لوحة PCR.تحتوي لوحة PCR عادةً على 96 بئراً ويمكنها تحليل عينات متعددة في نفس الوقت.

الخطوه 3

تضخيم PCR

بعد ذلك ، ضع اللوحة في آلة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، والتي تعد في الأساس جهاز تدوير حراري.

يتم استخدام RT-PCR في الوقت الحقيقي للكشف عن فيروس كورونا الجديد لعام 2019 عن طريق تضخيم التسلسل المستهدف في جين RdrRP والجين E والجين N.يعتمد اختيار الجين المستهدف على تسلسل التمهيدي والمسبار.

الخطوة الأولى في RT-PCR هي النسخ العكسي.يتم تصنيع الخيط الأول من الحمض النووي التكميلي ، والذي يبدأ بواسطة PCR التمهيدي العكسي ، والذي يرتبط بالجزء التكميلي من جينوم الحمض النووي الريبي الفيروسي.ثم يضيف النسخ العكسي نيوكليوتيدات الحمض النووي إلى النهاية الثالثة من التمهيدي لتخليق الحمض النووي المكمل للحمض النووي الريبي الفيروسي.تعتمد درجة حرارة ومدة هذه الخطوة على الاشعال والحمض النووي الريبي المستهدف والنسخ العكسي المستخدم.

بعد ذلك ، يتم تطبيق خطوة تمسخ أولية ، مما يؤدي إلى تمسخ طبيعة هجين RNA-DNA.هذه الخطوة ضرورية لتنشيط بوليميراز الدنا.في الوقت نفسه ، يتم تعطيل إنزيم النسخ العكسي.

يتكون PCR من سلسلة من الدورات الحرارية.كل دورة تتكون من تمسخ ، تلدين وخطوات تمديد.

تتضمن خطوة التمسخ تسخين غرفة التفاعل إلى 95 درجة مئوية واستخدامها لتمسخ قالب الحمض النووي المزدوج الشريطة.

في الخطوة التالية ، يتم تقليل درجة حرارة التفاعل إلى 58 درجة مئوية ، مما يسمح للطلاء التمهيدي الأمامي بالتصلب إلى الجزء التكميلي من قالب الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل.درجة حرارة التلدين تعتمد بشكل مباشر على طول وتكوين التمهيدي.

في خطوة التمديد ، يقوم بوليميراز الحمض النووي بتركيب خيط DNA جديد مكمل لقالب قالب الحمض النووي.عن طريق إضافة نوى مجانية مكملة للقالب في اتجاه 5 إلى 3′ من خليط التفاعل.تعتمد درجة حرارة هذه الخطوة على بوليميراز الدنا المستخدم.

بعد الدورة الأولى ، يتم الحصول على هدف DNA مزدوج الشريطة.

ثم أدخل الدورة الثانية.يتم تغيير طبيعة الحمض النووي مزدوج الشريطة لإنتاج جزيئين من الحمض النووي أحادي السلسلة.

في الخطوة التالية ، يتم خفض درجة حرارة التفاعل ، ويتم تلدين البادئات لكل قالب DNA أحادي الجديلة ، ويتم تلدين مسبار Taq-man إلى الجزء التكميلي من الحمض النووي المستهدف.

يتكون مسبار TaqMan من فلوروفور مرتبط تساهميًا بالنهاية الخامسة لمسبار قليل النوكليوتيد.عندما يكون متحمسًا بمصدر الضوء للدوران ، ينبعث الفلوروفور.بالإضافة إلى ذلك ، يتكون المسبار من جهاز إخماد في الطرف الثالث.إن قرب الجين المراسل من المخمد يمنع اكتشاف الفلورة.

في خطوة التمديد ، يصنع بوليميراز الحمض النووي خيطًا جديدًا.عندما يصل البوليميراز إلى مسبار TaqMan ، فإن نشاطه الداخلي 5 -nuclease يشق المسبار ، ويفصل الصبغة عن المخمد.

مع كل دورة PCR ، يتم إطلاق المزيد من جزيئات الصبغة ، مما يؤدي إلى زيادة شدة التألق بما يتناسب مع عدد الأمبليكونات المركبة.

تسمح هذه الطريقة بتقدير عدد تسلسل معين موجود في العينة.يتضاعف عدد شظايا الحمض النووي المزدوج الشريطة في كل دورة.لذلك ، يمكن استخدام PCR لتحليل عينات صغيرة جدًا.

لقياس إشارة الفلورسنت ، مصباح الهالوجين التنغستن ، مرشح الإثارة ، العاكس ، العدسة ، مرشح الانبعاث وكاميرا CCD المقترنة بالشحن.

الخطوة 4 كشف

لقياس إشارة الفلورسنت ، مصباح الهالوجين التنغستن ، مرشح الإثارة ، العاكس ، العدسة ، مرشح الانبعاث وكاميرا CCD المقترنة بالشحن.

ينعكس الضوء المرشح من المصباح بواسطة العاكس ، ويمر عبر عدسة المكثف ، ويركز على مركز كل ثقب.ثم ينعكس التألق المنبعث من الفتحة من المرآة ، ويمر عبر مرشح الانبعاث ، ويتم اكتشافه بواسطة كاميرا CCD.في كل دورة PCR ، يمكن الكشف عن ضوء الفلوروفور ذاتي الإثارة بواسطة CCD.

يقوم بتحويل الضوء الملتقط إلى بيانات رقمية.تسمى هذه الطريقة بتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ، وهي تتيح المراقبة في الوقت الفعلي لتقدم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.