كواحد جديد في المختبر ، ليس من الجيد استبعاد النباتات الإيجابية من مجموعة من النباتات ذات معدل التحويل المنخفض.أولاً ، يجب استخراج الحمض النووي من عدد كبير من العينات واحدة تلو الأخرى ، ثم يتم اكتشاف الجينات الأجنبية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.ومع ذلك ، فإن النتائج غالبًا ما تكون فارغة ونطاقات مع بعض العناصر أحيانًا ، ولكن من المستحيل تحديد ما إذا كانت هناك عمليات اكتشاف مفقودة أو اكتشافات خاطئة..هل هو عاجز للغاية لمواجهة مثل هذه العملية والنتائج التجريبية؟لا تقلق ، أخي يعلمك كيفية فحص النباتات الإيجابية المعدلة وراثيا بسهولة ودقة.

الخطوة 1

الاشعال الكشف عن التصميم

تحديد الجين الداخلي والجين الخارجي ليتم اكتشافهما وفقًا للعينة المراد اختبارها ، واختيار تسلسل تمثيلي 100-500 نقطة أساس في الجين لتصميم التمهيدي.يمكن أن تضمن الاشعال الجيدة دقة نتائج الكشف وتقصير وقت الكشف (انظر الملحق لمعرفة بادئات الكشف الشائعة الاستخدام).

ملاحظة: تحتاج البادئات المصممة حديثًا إلى تحسين ظروف التفاعل والتحقق من دقة ودقة وحد الكشف للكشف قبل الكشف على نطاق واسع.

الخطوة 2

تصميم البروتوكول التجريبي

التحكم الإيجابي: استخدم الحمض النووي المنقى الذي يحتوي على الجزء المستهدف كقالب لتحديد ما إذا كان نظام وظروف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل طبيعية.

التحكم السلبي / الفارغ: استخدم قالب الحمض النووي أو ddH2O الذي لا يحتوي على الجزء المستهدف كقالب لاكتشاف ما إذا كان هناك مصدر تلوث في نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل.

التحكم المرجعي الداخلي: استخدم مجموعة التمهيدي / المسبار للجين الداخلي للعينة المراد اختبارها لتقييم ما إذا كان يمكن اكتشاف القالب بواسطة PCR.

يلاحظ:

يجب ضبط الضوابط الإيجابية والسلبية / الفارغة وضوابط الرقابة الداخلية لكل اختبار لتقييم صحة النتائج التجريبية.

إعداد التجربة

قبل الاستخدام ، لاحظ ما إذا كان المحلول مختلطًا بالتساوي.إذا تم العثور على الترسيب ، يجب إذابته وخلطه وفقًا للتعليمات قبل الاستخدام.2 × مزيج PCR يحتاج إلى ماصة وخلطه بشكل متكرر باستخدام الماصة الدقيقة قبل الاستخدام لتجنب توزيع الأيونات غير المتكافئ.

يلاحظ:

قم بإخراج الدليل وقراءته بعناية ، وقم بإجراء الاستعدادات قبل التجربة بما يتفق بدقة مع متطلبات الدليل.

الخطوة 4

تحضير نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل

وفقًا للبروتوكول التجريبي ، قم بخلط البادئات ، H2O ، و 2 × PCR بالتساوي ، وأجهزة الطرد المركزي وتوزيعها على كل أنبوب رد فعل.

يلاحظ:

للاختبار على نطاق واسع أو طويل الأجل ، يوصى باستخدام نظام تفاعل PCR يحتوي على إنزيم UNG ، والذي يمكن أن يتجنب بشكل فعال تلوث الهباء الجوي الناجم عن منتجات PCR.

الخطوة الخامسة

أضف قالب التفاعل

باستخدام تقنية Direct PCR ، ليست هناك حاجة لعملية تنقية حمض نووي مملة ، يمكن تحضير قالب العينة في غضون 10 دقائق ، ويمكن إضافة نظام تفاعل PCR المقابل.

يلاحظ:

طريقة الانقسام لها تأثير كشف أفضل ، ويمكن استخدام المنتج الذي تم الحصول عليه لتفاعلات الكشف المتعددة.

5.1: التمدد المباشر للأوراق

وفقًا لحجم الصورة في الدليل ، قم بقطع أنسجة الأوراق بقطر 2-3 مم وضعها في نظام تفاعل PCR.

ملاحظة: تأكد من أن شظايا الأوراق مغمورة تمامًا في محلول تفاعل PCR ، ولا تضيف أنسجة الأوراق الزائدة.

5.2: طريقة تقسيم الأوراق

قطع الأنسجة الورقية بقطر 5-7 ملم ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.إذا اخترت الأوراق الناضجة ، فيرجى تجنب استخدام أنسجة الوريد الرئيسي للورقة.الماصة 50ul Buffer P1 محلول في أنبوب الطرد المركزي للتأكد من أن المحللة يمكن أن تغمر أنسجة الأوراق تمامًا ، وتضعها في دورة حرارية أو حمام معدني ، وليز عند 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.

أضف محلول تحييد 50ul Buffer P2 واخلطه جيدًا.يمكن استخدام المحللة الناتجة كقالب وإضافتها إلى نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

ملحوظة: كمية القالب تتراوح بين 5-10٪ من نظام PCR ، ويجب ألا تتجاوز 20٪ (على سبيل المثال ، في 20 مايكرولتر من نظام PCR ، أضف 1-2 مايكرولتر من محلول التحلل ، ليس أكثر من 4 مايكرولتر).

الخطوة 6

تفاعل PCR

بعد الطرد المركزي لأنبوب تفاعل PCR ، يتم وضعه في أداة PCR للتضخيم.

يلاحظ:

يستخدم التفاعل قالبًا غير منقى للتضخيم ، وبالتالي فإن عدد دورات التضخيم هو 5-10 دورات أكثر من استخدام قالب DNA المنقى.

الخطوة 7

كشف الرحلان الكهربائي وتحليل النتائج

M: 100bp DNA Ladder

1 \ 4: طريقة الحمض النووي المنقى

2 \ 5: طريقة PCR المباشرة

3 \ 6: تحكم فارغ

مراقبة الجودة:

يجب أن تستوفي نتائج الاختبار لعناصر التحكم المختلفة المحددة في التجربة الشروط التالية.خلاف ذلك ، يجب تحليل سبب المشكلة وإجراء الاختبار مرة أخرى بعد التخلص من المشكلة.

الجدول 1. نتائج الاختبار العادية لمجموعات التحكم المختلفة

* عند استخدام البلازميد كعنصر تحكم إيجابي ، يمكن أن تكون نتيجة اختبار الجينات الذاتية سلبية

نتيجة الحكم:

A. نتيجة اختبار الجين الداخلي للعينة سلبية ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المناسب لاكتشاف PCR العادي لا يمكن استخلاصه من العينة أو أن الحمض النووي المستخرج يحتوي على مثبطات تفاعل PCR ، ويجب استخراج الحمض النووي مرة أخرى.

ب. نتيجة اختبار الجين الداخلي للعينة إيجابية ، ونتائج اختبار الجين الخارجي سلبية ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المناسب للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي يتم استخراجه من العينة ، ويمكن الحكم على أن الجين XXX لم يتم اكتشافه في العينة.

ج- نتيجة اختبار الجين الداخلي للعينة إيجابية ، وكانت نتيجة اختبار الجين الخارجي موجبة ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المناسب للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي قد تم استخلاصه من العينة ، وأن عينة الحمض النووي تحتوي على الجين XXX.يمكن إجراء مزيد من تجارب التأكيد.

الخطوة 8

الاشعال الكشف عن التصميم

بعد التجربة ، استخدم محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2٪ و 70٪ من محلول الإيثانول لمسح المنطقة التجريبية لمنع التلوث البيئي。