ملخص
التحديد السريع للنباتات المعدلة وراثيا
نص / تونغ يوشنغ
عملية تجريبية / هان ينغ
محرر / ون يوجون
الكلمات / 1600 +
وقت القراءة المقترح / 8-10 دقائق
التحديد السريع للنباتات المعدلة وراثيا
كوافد جديد في المختبر ، ليس من الجيد استبعاد النباتات الإيجابية من مجموعة من النباتات ذات معدل التحويل المنخفض.أولاً ، يجب استخراج الحمض النووي من عدد كبير من العينات واحدة تلو الأخرى ، ثم يتم اكتشاف الجينات الأجنبية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.ومع ذلك ، فإن النتائج غالبًا ما تكون فارغة ونطاقات مع بعض العناصر أحيانًا ، ولكن من المستحيل تحديد ما إذا كانت هناك عمليات اكتشاف مفقودة أو اكتشافات خاطئة..هل هو عاجز للغاية لمواجهة مثل هذه العملية والنتائج التجريبية؟لا تقلق ، أخي يعلمك كيفية فحص النباتات الإيجابية المعدلة وراثيا بسهولة ودقة.
الخطوة 1: الاشعال الكشف عن التصميم
تحديد الجين الداخلي والجين الخارجي ليتم اكتشافهما وفقًا للعينة المراد اختبارها ، واختيار تسلسل تمثيلي 100-500 نقطة أساس في الجين لتصميم التمهيدي.يمكن أن تضمن الاشعال الجيدة دقة نتائج الكشف وتقصير وقت الكشف (انظر الملحق لمعرفة بادئات الكشف الشائعة الاستخدام).
ملحوظة:
تحتاج البادئات المصممة حديثًا إلى تحسين ظروف التفاعل والتحقق من الدقة والدقة وحد الكشف للكشف قبل إجراء الكشف على نطاق واسع.
الخطوة 2:تطوير بروتوكول تجريبي
التحكم الإيجابي: استخدم الحمض النووي المنقى الذي يحتوي على الجزء المستهدف كقالب لتحديد ما إذا كان نظام وظروف تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل طبيعية.
التحكم السلبي / الفارغ: استخدم قالب DNA أو ddH2O التي لا تحتوي على الجزء المستهدف كقالب لاكتشاف ما إذا كان هناك مصدر تلوث في نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل.
التحكم المرجعي الداخلي: استخدم مجموعة التمهيدي / المسبار للجين الداخلي للعينة المراد اختبارها لتقييم ما إذا كان يمكن اكتشاف القالب بواسطة PCR.
ملحوظة:
يجب ضبط الضوابط الإيجابية والسلبية / الفارغة وضوابط الرقابة الداخلية لكل اختبار لتقييم صحة النتائج التجريبية.
الخطوه 3: إعداد التجربة
قبل الاستخدام ، لاحظ ما إذا كان المحلول مختلطًا بالتساوي.إذا تم العثور على الترسيب ، يجب إذابته وخلطه وفقًا للتعليمات قبل الاستخدام.2 × مزيج PCR يحتاج إلى ماصة وخلطه بشكل متكرر باستخدام الماصة الدقيقة قبل الاستخدام لتجنب توزيع الأيونات غير المتكافئ.
ملحوظة:
خذ التعليمات واقرأها بعناية ، وقم بعمل الاستعدادات قبل التجربة مع الالتزام الصارم بالتعليمات.
الخطوة 4: تحضير نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
وفقًا للبروتوكول التجريبي ، قم بخلط الاشعال ، H.2يا ، 2 × مزيج PCR ، والطرد المركزي وتوزيعها على كل أنبوب رد فعل.
ملحوظة:
للاختبار على نطاق واسع أو طويل الأجل ، يوصى باستخدام نظام تفاعل PCR يحتوي على إنزيم UNG ، والذي يمكن أن يتجنب بشكل فعال تلوث الهباء الجوي الناجم عن منتجات PCR.
الخطوة 5: أضف نموذج التفاعل
باستخدام تقنية Direct PCR ، ليست هناك حاجة لعملية تنقية حمض نووي مملة.يمكن تحضير نموذج النموذج في غضون 10 دقائق وإضافته إلى نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابل.
ملحوظة:
طريقة التحلل لها تأثير كشف أفضل ، ويمكن استخدام المنتج الذي تم الحصول عليه لتفاعلات الكشف المتعددة.
5.1: تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر للأوراق
وفقًا لحجم الصورة في الدليل ، قم بقطع أنسجة الأوراق بقطر 2-3 مم وضعها في نظام تفاعل PCR.
ملاحظة: تأكد من أن شظايا الأوراق مغمورة تمامًا في محلول تفاعل PCR ، ولا تضيف أنسجة الأوراق الزائدة.
5.2: طريقة تحلل الأوراق
قطع الأنسجة الورقية بقطر 5-7 ملم ووضعها في أنبوب الطرد المركزي.إذا اخترت الأوراق الناضجة ، فيرجى تجنب استخدام أنسجة الوريد الرئيسي للورقة.الماصة 50ul Buffer P1 محلول في أنبوب الطرد المركزي للتأكد من أن المحللة يمكن أن تغمر أنسجة الأوراق تمامًا ، وتضعها في دورة حرارية أو حمام معدني ، وليز عند 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
أضف محلول تحييد 50ul Buffer P2 واخلطه جيدًا.يمكن استخدام المحللة الناتجة كقالب وإضافتها إلى نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
ملحوظة: يجب أن تكون كمية القالب بين 5-10٪ من نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويجب ألا تتجاوز 20٪ (على سبيل المثال ، في 20 مايكرولتر من نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 1-2 مايكرولتر من محلول التحلل ، ليس أكثر من 4 ميكرولتر).
الخطوة 6: تفاعل PCR
بعد الطرد المركزي لأنبوب تفاعل PCR ، ضعهم في أداة PCR للتضخيم.
ملحوظة:
يستخدم التفاعل قالبًا غير منقى للتضخيم ، وبالتالي فإن عدد دورات التضخيم هو 5-10 دورات أكثر من استخدام قالب DNA المنقى.
الخطوة 7: الكشف عن الرحلان الكهربي وتحليل النتائج
M: 100bp DNA Ladder
1 \ 4: طريقة الحمض النووي المنقى
2 \ 5: طريقة PCR المباشرة
3 \ 6: تحكم فارغ
رقابة جودة:
يجب أن تستوفي نتائج الاختبار الخاصة بعناصر التحكم المختلفة المحددة في التجربة الشروط التالية.خلاف ذلك ، يجب تحليل سبب المشكلة وإجراء الاختبار مرة أخرى بعد التخلص من المشكلة.
الجدول 1. نتائج الاختبار العادية لمجموعات التحكم المختلفة
* عند استخدام البلازميد كعنصر تحكم إيجابي ، يمكن أن تكون نتيجة اختبار الجينات الذاتية سلبية
نتيجة الحكم:
A. نتيجة اختبار الجين الداخلي للعينة سلبية ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المناسب لاكتشاف PCR العادي لا يمكن استخلاصه من العينة أو أن الحمض النووي المستخرج يحتوي على مثبطات تفاعل PCR ، ويجب استخراج الحمض النووي مرة أخرى.
ب. نتيجة اختبار الجين الداخلي للعينة إيجابية ، ونتائج اختبار الجين الخارجي سلبية ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المناسب للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي يتم استخراجه من العينة ، ويمكن الحكم على أن الجين XXX لم يتم اكتشافه في العينة.
ج. نتيجة اختبار الجين الداخلي للعينة إيجابية ، ونتائج اختبار الجين الخارجي إيجابية ، مما يشير إلى أن الحمض النووي المناسب للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي قد تم استخلاصه من العينة ، وأن عينة الحمض النووي تحتوي على الجين XXX.يمكن إجراء مزيد من تجارب التأكيد.
الخطوة 8: تصميم الاشعال للكشف
بعد التجربة ، استخدم محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2٪ و 70٪ من محلول الإيثانول لمسح المنطقة التجريبية لمنع التلوث البيئي.
زائدة
الجدول 2. مواد أولية شائعة الاستخدام للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العام للنباتات المعدلة وراثيًا
وثيقة مرجعية:
SN / T 1202-2010 ، طريقة الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي للمكونات النباتية المعدلة وراثيًا في الغذاء.
اعلان وزارة الزراعة 1485-5-2010 ، اختبار مكونات النباتات المعدلة وراثيا ومنتجاتها - الأرز M12 ومشتقاته.
الوقت ما بعد: 2021 يونيو 09
