Ⅰ. زيادة حساسية نظام التفاعل:

1. RNA منفصل عالي الجودة:

يأتي تخليق (كدنا) الناجح من الحمض النووي الريبي عالي الجودة.يجب أن يضمن الحمض النووي الريبي عالي الجودة على الأقل إجماليًا أطول ولا يحتوي على مثبطات لا تحتوي على إنزيمات تسجيل ، مثل EDTA أو SDS.تحدد جودة RNA القيمة القصوى لمعلومات التسلسل التي يمكنك نسخها إلى cDNA.طريقة تنقية الحمض النووي الريبي العامة هي طريقة خطوة لاستخدام أيزوسيانات / أسيدوفينول.من أجل منع تلوث الحمض النووي الريبي ، فإن الحمض النووي الريبي المنفصل عن عينة غنية بـ RNase (مثل البنكرياس) يتطلب تخزين الفورمالديهايد لحفظ الحمض النووي الريبي عالي الجودة ، وهو أمر أكثر أهمية للتخزين طويل الأجل.تم تحلل الحمض النووي الريبي المستخرج من كبد الفئران بشكل أساسي بعد أسبوع واحد من التخزين في الماء ، بينما ظل الحمض النووي الريبي المستخرج من طحال الفئران مستقرًا بعد ثلاث سنوات من التخزين في الماء.بالإضافة إلى ذلك ، تعد النصوص الأكبر من 4 كيلوبايت أكثر حساسية لتتبع تدهور RNase من النصوص الصغيرة.من أجل زيادة استقرار عينة تخزين الحمض النووي الريبي ، يمكن إذابة الحمض النووي الريبي في ميثالامين من أيون ، ويتم تخزينه -70 درجة مئوية.يجب ألا يحتوي Thylide المستخدم لحفظ RNA على كائن متنوع يحط من RNA.يمكن حفظ الحمض النووي الريبي ، المشتق من البنكرياس ، في الميثالمامين لمدة عام على الأقل.عندما تكون جاهزًا لاستخدام الحمض النووي الريبي ، يمكنك استخدام الطرق التالية لترسيب الحمض النووي الريبي: إضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.2 متر و 4 أضعاف حجم الإيثانول ، ووضع درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق ، و 10000 × جرام بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق.

2. استخدام النسخ العكسي بدون نشاط RNaseH (RNaseH-) ：

غالبًا ما تُضاف مثبطات RNase لعكس تفاعلات النسخ لزيادة طول وإنتاج تخليق (كدنا).يضاف مثبط RNase في أول تفاعل تخليقي متسلسل في وجود مخازن وعوامل مختزلة مثل DTT لأن عملية التوليف السابقة لـ cDNA تفسد المانع ، وبالتالي تطلق RNases المرتبطة التي تحلل الحمض النووي الريبي.يمنع مثبط البروتين RNase فقط تدهور الحمض النووي الريبي بواسطة RNase A و B و C ولا يمنع RNases على الجلد ، لذلك يجب الحرص على عدم إدخال RNases من الأصابع على الرغم من استخدام هذه المثبطات.

إن إنزيم النسخ العكسي يحفز تحويل الحمض النووي الريبي إلى (كدنا).كل من M-MLV و AMV لهما نشاط RNaseH داخلي بالإضافة إلى نشاط البوليميراز الخاص بهما.يتنافس نشاط RNaseH مع نشاط البوليميراز للخيوط غير المتجانسة المتكونة بين قوالب الحمض النووي الريبي (RNA) وبادئات الحمض النووي (DNA) أو خيوط التمديد (cDNA) ، ويؤدي إلى تدهور خيوط RNA: RNA في مجمعات الحمض النووي.لم يعد من الممكن استخدام قوالب الحمض النووي الريبي المتدهورة بواسطة نشاط RNaseH كركائز فعالة لتوليف (كدنا) ، مما يقلل من إنتاج وطول تخليق (كدنا).وبالتالي فإن القضاء على نشاط RNaseH للنسخ العكسي أو الحد منه بشكل كبير سيكون ذا فائدة كبيرة.

أسفرت نسخة SuperScriptⅡ العكسية ، ونسخة MMLV العكسية لـ RNaseH- ونسخة عكسية حرارية ، AMV لـ RNaseH- عن cDNA كامل الطول أكثر من MMLV و AMV.تتأثر حساسية RT-PCR بكمية (كدنا) المركبة.يعتبر ThermoScript أكثر حساسية من AMV.يقتصر حجم منتجات RT-PCR على قدرة النسخ العكسي على تخليق cDNA ، خاصة عند استنساخ Cdnas الأكبر.مقارنةً بـ MMLV ، زادت SuperScrip بشكل كبير من إنتاجية منتجات RT-PCR الطويلة.يزيد النسخ العكسي لـ RNaseH أيضًا من الثبات الحراري ، لذلك يمكن إجراء التفاعل في درجات حرارة أعلى من المعتاد من 37-42 ℃.في ظل ظروف التوليف المقترحة ، تم استخدام بادئات oligo (dT) و 10μCi [alpha-p] dCTP.تم حساب الإنتاج الإجمالي للسلسلة الأولى باستخدام طريقة ترسيب TCA.تم تحليل (كدنا) كامل الطول باستخدام إزالة الشريط المصنف بالحجم والعد في هلام الاغاروز القلوي.

3. زيادة درجة حرارة الحفاظ على الحرارة للنسخ العكسي ：

تساعد درجة حرارة التثبيت العالية على فتح الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي وزيادة إنتاجية التفاعل.بالنسبة لمعظم قوالب الحمض النووي الريبي ، فإن الاحتفاظ بـ RNA والبرايمر عند 65 درجة مئوية بدون عازلة أو ملح ثم تبريدهما بسرعة على الجليد يزيل معظم الهياكل الثانوية ويسمح للبادئات بالارتباط.ومع ذلك ، لا تزال بعض القوالب لها بنية ثانوية ، حتى بعد التمسخ الحراري.يمكن إجراء تضخيم هذه القوالب الصعبة باستخدام النسخ العكسي ThermoScript وعن طريق وضع تفاعل النسخ العكسي في درجات حرارة أعلى لتحسين التضخيم.يمكن أن تزيد درجات حرارة التثبيت العالية أيضًا من النوعية ، خاصةً عند إجراء تخليق cDNA باستخدام بادئات خاصة بالجينات (GSPS) (انظر الفصل 3).إذا كنت تستخدم نظام الأفضليات المعمم ، فتأكد من أن قيمة Tm للبرايمر هي نفس درجة حرارة التثبيت المتوقعة.لا تستخدم oligo (dT) والبرايمر العشوائي فوق 60 ℃.يجب أن تبقى البرايمر العشوائية عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل أن تزيد إلى 60 درجة مئوية.بالإضافة إلى استخدام درجات حرارة النسخ العكسي الأعلى ، يمكن تحسين النوعية عن طريق النقل المباشر لمزيج RNA / التمهيدي من درجة حرارة تغيير طبيعة 65 درجة مئوية إلى درجة حرارة الاحتفاظ بالنسخ العكسي وإضافة خليط تفاعل مسخن 2 × (تخليق بدء حراري cDNA).يساعد هذا النهج في منع الاقتران بين الجزيئات الأساسي الذي يحدث في درجات حرارة منخفضة.يؤدي استخدام أداة PCR إلى تبسيط العديد من مفاتيح تبديل درجة الحرارة المطلوبة لـ RT-PCR.

يعمل البوليميراز المستقر بالحرارة Tth كبوليميراز DNA في وجود Mg2 + و RNA polymerase في وجود Mn2 +.يمكنها الاحتفاظ بالحرارة حتى 65.ومع ذلك ، فإن وجود Mn2 + أثناء PCR يقلل من الدقة ، مما يجعل Tth polymerase أقل ملاءمة للتضخيم عالي الدقة ، مثل استنساخ cDNA.بالإضافة إلى ذلك ، يكون Tth أقل كفاءة في النسخ العكسي ، مما يقلل من الحساسية ، وبما أن إنزيمًا واحدًا يمكنه إجراء النسخ العكسي و PCR ، فلا يمكن استخدام تفاعلات التحكم دون النسخ العكسي للتمييز بين المنتجات المضخمة من cDNA وتلك الخاصة بالحمض النووي الجيني الملوث.

4. مادة مضافة تعزز النسخ العكسي ：

يمكن أن تؤدي إضافة المواد المضافة ، بما في ذلك الجلسرين و DMSO ، إلى تفاعل التوليف المتسلسل الأول إلى تقليل ثبات الشريط المزدوج للحمض النووي وتخفيف البنية الثانوية للحمض النووي الريبي.يمكن إضافة ما يصل إلى 20٪ جلسرين أو 10٪ DMSO دون التأثير على نشاط SuperScriptⅡ أو MMLV.يمكن أيضًا أن يتحمل AMV ما يصل إلى 20٪ من الجلسرين دون تقليل النشاط.لتعظيم حساسية RT-PCR في تفاعل النسخ العكسي SuperScript ، يمكن إضافة 10٪ من الجلسرين وعزله عند 45 درجة مئوية.إذا تمت إضافة 1/10 من منتج تفاعل النسخ الرجعي إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فإن تركيز الجلسرين في تفاعل التضخيم يكون 0.4٪ ، وهو ما لا يكفي لتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل.

5. معالجة RNaseH ：

يمكن تحسين الحساسية عن طريق معالجة تفاعلات تخليق (كدنا) مع RNaseH قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل.بالنسبة لبعض القوالب ، يُعتقد أن الحمض النووي الريبي في تفاعل تخليق (كدنا) يمنع ارتباط المنتجات المضخمة ، وفي هذه الحالة يمكن أن يزيد علاج RNaseH من الحساسية.بشكل عام ، مطلوب علاج RNaseH لتضخيم قالب هدف طويل نسبيًا (كدنا) طويل نسبيًا ، مثل داء الفصام الدرني بنسخة منخفضة.بالنسبة لهذا القالب الصعب ، عزز RNaseH الإشارة الناتجة عن cDNA المركب بواسطة SuperScriptⅡ أو AMV.بالنسبة لمعظم تفاعلات RT-PCR ، يكون علاج RNaseH اختياريًا لأن خطوة تمسخ PCR المعزولة 95 ℃ تحلل الحمض النووي الريبي من RNA: مجمع DNA.

6. طرق محسنة للكشف عن الكميات الصغيرة من الحمض النووي الريبي (RNA) ：

يعتبر RT-PCR تحديًا بشكل خاص عند توفر كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي.تساعد إضافة الجليكوجين كناقل أثناء فصل الحمض النووي الريبي في زيادة إنتاجية العينات الصغيرة.يمكن إضافة الجليكوجين الخالي من RNase في نفس الوقت مثل Trizol.الجليكوجين قابل للذوبان في الماء ويمكن أن يبقى في الطور المائي مع RNA للمساعدة في الترسيب اللاحق.التركيز الموصى به من الجليكوجين الخالي من RNase هو 250 ميكروغرام / مل لعينات أقل من 50 ملغ من الأنسجة أو 106 خلية مزروعة.

يمكن أن تؤدي إضافة BSA الأسيتيل لعكس تفاعلات النسخ باستخدام SuperScriptⅡ إلى زيادة الحساسية ، وبالنسبة للكميات الصغيرة من الحمض النووي الريبي ، فإن تقليل كمية SuperScriptⅡ وإضافة 40 وحدة من مثبط نوكلياز RnaseOut يمكن أن يحسن مستوى الكشف.إذا تم استخدام الجليكوجين في فصل الحمض النووي الريبي ، فلا يزال يوصى بإضافة مثبطات BSA أو RNase لعكس تفاعلات النسخ باستخدام SuperScriptⅡ.

Ⅱ. زيادة خصوصية RT-PCR

1. التوليف cNDA ：

يمكن استخدام ثلاث طرق مختلفة لبدء توليف cDNA الأول ، وتؤثر الخصوصية النسبية لكل طريقة على كمية ونوع cDNA المركب.

طريقة التمهيدي العشوائية هي الأقل تحديدًا من بين الطرق الثلاث.يتم تلدين الاشعال في مواقع متعددة في جميع أنحاء النسخة لإنتاج (كدنا) قصير وجزئي الطول.غالبًا ما تُستخدم هذه الطريقة للحصول على تسلسلات 5-طرفية و cDNA من قوالب RNA مع مناطق هيكلية ثانوية أو مع مواقع إنهاء لا يمكن نسخ نسخة عكسية منها.للحصول على أطول (كدنا) ، يجب تحديد نسبة البادئات إلى الحمض النووي الريبي في كل عينة من الحمض النووي الريبي تجريبياً.يتراوح التركيز الأولي للأشعال العشوائية من 50 إلى 250 نانوغرام لكل 20 ميكرولتر من نظام التفاعل.نظرًا لأن (كدنا) المركب من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الاشعال العشوائي هو أساسًا الحمض النووي الريبي الريبوزومي ، يتم تحديد بولي (A) + RNA عمومًا كقالب.

يعتبر بدء Oligo (dT) أكثر تحديدًا من البادئات العشوائية.يتهجين مع ذيل بولي (A) الموجود في نهاية 3 من الرنا المرسال في معظم الخلايا حقيقية النواة.نظرًا لأن poly (A) + RNA ما يقرب من 1 ٪ إلى 2 ٪ من إجمالي RNA ، فإن كمية وتعقيد cDNA أقل بكثير مما لو تم استخدام بادئات عشوائية.بسبب خصوصيتها العالية ، لا تتطلب oligo (dT) عمومًا تحسين نسبة RNA إلى التمهيدي واختيار poly (A) +.يوصى باستخدام 0.5 ميكروغرام أوليغو (dT) لكل 20 مايكرولتر من نظام التفاعل.oligo (dT) 12-18 مناسب لمعظم RT-PCR.يوفر نظام ThermoScript RT-PCR أوليجو (dT) 20 نظرًا لاستقراره الحراري الجيد ومناسب لدرجات حرارة تثبيت أعلى.

البادئات الخاصة بالجينات (GSP) هي أفضل بادئات محددة لخطوة النسخ العكسي.GSP عبارة عن أليغنوكليوسيد مضاد للحساسية يمكن أن يتهجين على وجه التحديد مع تسلسل وجهة RNA ، بدلاً من صلب جميع Rnas مثل البادئات العشوائية أو oligo (dT).تنطبق القواعد المستخدمة في تصميم بادئات PCR أيضًا على تصميم تفاعل النسخ العكسي GSP.يمكن أن يكون GSP هو نفس تسلسل تمهيدي التضخيم الملدن في نهاية mRNA3 ′ ، أو يمكن تصميم GSP ليتم تلدينه في اتجاه مجرى النهر باستخدام تمهيدي التضخيم العكسي.بالنسبة لبعض الكائنات المضخمة ، من الضروري تصميم أكثر من أساس واحد مضاد للتفاعل لـ RT-PCR لأن الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي المستهدف قد يمنع التمهيدي من الارتباط.يُقترح استخدام 1pmol GSP المضاد للحساسية في أول نظام تفاعل تخليقي متسلسل يبلغ 20 ميكرولتر.

2. زيادة درجة حرارة الحفاظ على الحرارة للنسخ العكسي ：

من أجل الاستفادة الكاملة من خصوصية نظام الأفضليات المعمم ، يجب استخدام النسخ العكسي ذي الثبات الحراري العالي.يمكن عزل النسخ العكسي المستقر الحرارة في درجات حرارة أعلى لزيادة صرامة التفاعل.على سبيل المثال ، إذا تم تلدين GSP عند 55 درجة مئوية ، فلن يتم استخدام خصوصية GSP بالكامل إذا تم إجراء النسخ العكسي عند 37 درجة مئوية مع صرامة منخفضة باستخدام AMV أو M-MLV.ومع ذلك ، يمكن أن يتفاعل SuperScripⅡ و ThermoScript عند 50 درجة مئوية أو أعلى ، مما يلغي المنتجات غير المحددة التي يتم إنتاجها في درجات حرارة منخفضة.للحصول على أقصى قدر من الخصوصية ، يمكن نقل خليط RNA / التمهيدي مباشرة من درجة حرارة تمسخ 65 درجة مئوية إلى درجة حرارة الاحتفاظ بالنسخ العكسي مع إضافة خليط تفاعل مسخن 2 × (بدء حراري لتخليق (كدنا)).هذا يساعد على منع الاقتران الأساسي بين الجزيئات في درجات حرارة منخفضة.يؤدي استخدام أداة PCR إلى تبسيط العديد من انتقالات درجات الحرارة المطلوبة لـ RT-PCR.

3. الحد من تلوث الحمض النووي الجيني ：

تتمثل إحدى الصعوبات المحتملة في RT-PCR في أن الحمض النووي الريبي يلوث الحمض النووي الجيني.استخدام أفضل طرق فصل الحمض النووي الريبي ، مثل Trizol Reagent ، يقلل من تلوث الحمض النووي الجيني في مستحضرات الحمض النووي الريبي.لتجنب المنتجات المنتجة من الحمض النووي الجيني ، يمكن معالجة الحمض النووي الريبي باستخدام درجة تضخيم DnasⅠ لإزالة الحمض النووي الملوث قبل النسخ العكسي.تم حفظ العينات عند 65 في 2.0 ملي مولار EDTA لمدة 10 دقائق لإنهاء هضم DNase.EDTA مخلّب أيونات المغنيسيوم لمنع تحلل الحمض النووي الريبي المعتمد على أيون المغنيسيوم والذي يحدث في درجات حرارة عالية.

من أجل فصل cDNA المضخم عن منتج تضخيم DNA الجينوم ، يمكن تصميم البادئات التي تصلب بشكل منفصل مع exon المنفصل.ستكون منتجات PCR المشتقة من (كدنا) أقصر من تلك المشتقة من الحمض النووي الجيني الملوث.يتم أيضًا إجراء تجربة مضبوطة بدون نسخ عكسي على كل قالب RNA لتحديد ما إذا كان جزء معين من الحمض النووي الجيني أو cDNA.مشتق من الجينوم منتجات PCR التي تم الحصول عليها في غياب النسخ العكسي.

المنتجات ذات الصلة

RT-PCR سهل^ᵀᴹأنا (خطوة واحدة)

- تتيح المجموعة المكونة من خطوة واحدة إجراء النسخ العكسي و PCR في نفس الأنبوب.يحتاج فقط إلى إضافة قالب RNA ، وأشعال PCR محددة و RNase-Free ddH₂O.

- يمكن إجراء التحليل الكمي في الوقت الحقيقي للـ RNA بسرعة وبدقة.

- تستخدم المجموعة كاشف النسخ العكسي الفريد Foregene و Foregene HotStar Taq DNA Polymerase جنبًا إلى جنب مع نظام تفاعل فريد لتحسين كفاءة التضخيم وخصوصية التفاعل بشكل فعال.

- نظام التفاعل المحسن يجعل التفاعل يتمتع بحساسية كشف أعلى واستقرار حراري أقوى وتحمل أفضل.

RT Easy II (مع GDNase) Master Premix لتوليف CDNA الأول في الوقت الحقيقي PCR مع GDNase

- قدرة فعالة على إزالة جدنا ، والتي يمكن أن تزيل جدنا في القالب في غضون دقيقتين.

-نظام نسخ عكسي فعال ، يستغرق 15 دقيقة فقط لإكمال توليف أول حبلا (كدنا).

- القوالب المعقدة: يمكن أيضًا عكس القوالب ذات المحتوى العالي من GC والبنية الثانوية المعقدة بكفاءة عالية.

-نظام النسخ العكسي عالي الحساسية ، يمكن للقوالب على مستوى pg أيضًا الحصول على cDNA عالي الجودة.

- يتمتع نظام النسخ العكسي باستقرار حراري عالي ، ودرجة حرارة التفاعل المثلى هي 42 درجة مئوية ، ولا يزال يتمتع بأداء نسخ عكسي جيد عند 50 درجة مئوية.