لا يمكن أن تتحمل النسخ العكسية التقليدية درجات حرارة عالية (درجة الحرارة المثلى لنشاط MMLV هي 37-50 درجة مئوية ، و AMV هي 42-60 درجة مئوية).لا يمكن عكس RNA الفيروسي الأكثر تعقيدًا بشكل فعال إلى cDNA عند درجات حرارة منخفضة ، مما يؤدي إلى كفاءة الكشف.يتطلب RT-qPCR التقليدي عمومًا مشاركة إنزيمين رئيسيين (النسخ العكسي وبوليميراز الحمض النووي) ، مما يجعل من المستحيل تبسيط تشغيل نظام التفاعل وتقليل التكلفة.هنا سوف نقدم اثنين من النسخ العكسية المقاومة للحرارة العالية ، TtH و RevTaq.يحتوي هذان الإنزيمان أيضًا على وظيفة بوليميريز الحمض النووي ، لذلك يطلق عليهما الإنزيمات ثنائية الوظيفة.

بوليميراز الحمض النووي TtH

يجب أن تكون قد سمعت عن TtH ، المشتق من البكتيريا المحبة للحرارة Thermus thermophilus HB8.في وجود الكاتيونات ثنائية التكافؤ مثل Mg2 + ، يكون لها نشاط بوليميريز DNA.يستخدم على نطاق واسع في تفاعلات PCR مثل إنزيم Taq ، ولكنه يتمتع بمقاومة أعلى للحرارة من إنزيم Taq ، لذلك له أيضًا تأثير أفضل على PCR مع قوالب محتوى GC عالية.

· لا يحتوي هذا الإنزيم أساسًا على نشاط نوكلياز خارجي 3 → 5 ونشاط نوكلياز خارجي 5 → 3 ، لذلك يمكن استخدامه أيضًا لتسلسل ديوكسي.

· هذا الإنزيم له نشاط RTase.في وجود Mn2 + ، سيتم تعزيز نشاط RTase.باستخدام هذه الميزة ، يمكن استخدامها لإجراء تفاعل النسخ العكسي ورد فعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في نفس الأنبوب ، أي خطوة واحدة RT-PCR.ومع ذلك ، في وجود Mn2 + ، فإن دقة RT-PCR ليست عالية.نشاط RT ليس له علاقة بنشاط rnaase H.

· الفعالية المتزايدة لبوليميراز Tth-DNA (pH9 ، الأمثل + 55 ～ + 70 ℃ ، الحد الأقصى + 95 ℃) يتغلب على المشاكل التي تسببها البنية الثانوية للحمض النووي الريبي.يمكن تضخيم cDNA الناتج بواسطة PCR بنفس الإنزيم في وجود Mg2 + أيونات.

· إن قدرة بوليميراز Tth-DNA على إجراء النسخ العكسي وتضخيم الحمض النووي في درجات حرارة عالية تجعل هذا الإنزيم مفيدًا في التحليل الكمي لـ RT-PCR والاستنساخ والتحليل الجيني للحمض النووي الريبي الخلوي والفيروسي.
يستخدم بوليميراز Tth-DNA في RT-PCR لتضخيم الحمض النووي الريبي حتى 1 كيلو بايت.

الميزات والمزايا

بوليميراز الحمض النووي Tth:

• ضمان الحجم الأمثل لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، على الأقل 1000 نقطة أساس في تفاعل RT-PCR

• قبول تعديل ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوزيد كركيزة

• لا علاقة لها بنشاط RNase H.

• يتمتع باستقرار حراري مرتفع للتغلب على المشكلات ، والتي تتعلق عادةً بالبنية الثانوية العالية الموجودة في الحمض النووي الريبي

RevTaq RT ‐ PCR DNA polymerase

بوليميراز DNA مقاوم للحرارة مع نشاط النسخ العكسي

إن إنزيم RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase هو إنزيم مُصمم هندسيًا ومقاوم للحرارة للغاية وذو وظيفتين مع إنزيم النسخ العكسي وأنشطة بوليميريز الحمض النووي التي تم الحصول عليها من خلال التطور الموجه والاصطناعي.

· العمر النصفي لبوليميراز DNA RevTaq RT-PCR عند 95 درجة مئوية أكبر من 40 دقيقة.

يسمح بوليميراز DNA RevTaq RT-PCR بالنسخ العكسي بدرجة حرارة عالية مباشرة من قالب RNA ، ويمكن تكرار خطوة النسخ العكسي عدة مرات لتوليد المزيد من قوالب (كدنا).

يسمح بوليميراز DNA RevTaq RT-PCR بـ RT-PCR "بخطوة صفرية" (بدون خطوة نسخ عكسي متساوي الحرارة) ، لأنه في خطوة تمديد PCR الدوري ، يحدث النسخ العكسي وتضخيم الحمض النووي في وقت واحد.يعزز هذا أيضًا تفاعل النسخ العكسي في درجات حرارة عالية ، وبالتالي تقليل المشكلات التي تواجهها في ذوبان البنية الثانوية القوية في الحمض النووي الريبي في درجات حرارة عالية.

· نظرًا لتركيبة البدء الساخن القائمة على aptamer ، فإن بوليميراز DNA RevTaq RT-PCR سوف ينتج نتائج أفضل عندما تكون درجة حرارة التلدين والتمديد أعلى من 57 درجة مئوية.

· بما أن الإنزيم مقاوم للحرارة ، يوصى بتصميم البادئات والمسبار بنقاط انصهار عالية جدًا (> 60 درجة مئوية).

· يوصى بتحسين درجة حرارة خطوة التلدين / التمديد من خلال تدرج درجة الحرارة أثناء عملية إعداد التفاعل.

· كلما ارتفعت درجة الحرارة ، زادت خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل.عادة ما يتم إجراء دورة النسخ العكسي عند درجة حرارة أعلى من دورة PCR ، لأن DNA Primer: RNA Template hybridization عادةً ما يكون له نقطة انصهار أعلى من DNA Primer: cDNA Template duplex.

• تم تصميم بوليميريز DNA RevTaq RT-PCR وتحسينه وراثيًا ، ويتراوح حجم الأمبليكون بين 60-300 زوج قاعدي.

يصل حد الكشف عن بوليميريز DNA RevTaq RT-PCR إلى 4 نسخ /

يظهر في الشكل نظام التفاعل الأمثل (إنشاء بادئات ذات درجة انصهار عالية).يُظهر RT-PCR الذي يحركه RT-PCR الذي يحركه البوليميريز DNA من RevTaq حساسية أفضل من المزيج الرئيسي لـ TaqPath 1-step RT-qPCR ، وتدرج تخفيف عينة الكشف المنخفض.

المزيد من المزايا:

وظيفة البدء السريع → يمكن تخطي خطوة التمسخ الحراري الأولي.

صيغة أبتامير البدء الساخن ← توفر نشاط إنزيم بنسبة 100٪ على الفور وتمنع التضخيم غير المحدد في درجات حرارة منخفضة (<57 درجة مئوية).

وظيفة الانقسام → تم حذف خطوة استخراج الحمض النووي الريبي ، لأن بوليميريز DNA RevTaq RT-PCR يمكنه أيضًا معالجة عينات التفاعل الخام.يمكنه على الفور تدمير أغشية الخلايا من حقيقيات النوى والبكتيريا والفيروسات في دورة RT-PCR الساخنة.

مستوى المواد الخام IVD ← معايير جودة عالية وأسعار تنافسية للغاية