• PCR هي طريقة تستخدم لتضخيم الحمض النووي من كمية صغيرة من قالب الحمض النووي.يستخدم RT-PCR النسخ العكسي لإنتاج قالب الحمض النووي من مصدر الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يمكن بعد ذلك تضخيمه.
• PCR وRT-PCR عادة ما تكون تفاعلات نقطة النهاية، بينما يستخدم qPCR وRT-qPCR حركية معدل تخليق المنتج أثناء تفاعل PCR لتحديد كمية القالب الموجود.
• توفر الأساليب الأحدث، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي، تقديرًا كميًا مطلقًا لقالب الحمض النووي الأولي، بينما تقلل الأساليب مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل متساوي الحرارة من الحاجة إلى معدات باهظة الثمن لتوفير نتائج موثوقة.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تقنية بيولوجيا جزيئية بسيطة نسبيًا ومستخدمة على نطاق واسع لتضخيم وكشف تسلسل الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA).بالمقارنة مع الطرق التقليدية لاستنساخ الحمض النووي وتضخيمه، والتي يمكن أن تستغرق في كثير من الأحيان أيامًا، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل لا يتطلب سوى بضع ساعات.PCR حساس للغاية ويتطلب الحد الأدنى من القالب للكشف عن تسلسلات محددة وتضخيمها.لقد تطورت طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسية بشكل أكبر بدءًا من الكشف البسيط عن الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA).أدناه، قدمنا ​​نظرة عامة على طرق PCR المختلفة والكواشف التي نقدمها في Enzo Life Sciences لتلبية احتياجاتك البحثية.نحن نهدف إلى مساعدة العلماء على الوصول بسرعة إلى كواشف PCR لاستخدامها في مشروعهم البحثي القادم!

تفاعل البوليميراز المتسلسل

بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي، كل ما تحتاجه هو بوليميريز الحمض النووي، والمغنيسيوم، والنيوكليوتيدات، والبادئات، وقالب الحمض النووي المراد تضخيمه، ودراجة حرارية.آلية تفاعل البوليميراز المتسلسل بسيطة مثل غرضها: 1) يتم تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج (dsDNA) بالحرارة، 2) تتم محاذاة البادئات مع خيوط الحمض النووي المفردة، و3) يتم تمديد البادئات بواسطة بوليميراز الحمض النووي، مما يؤدي إلى نسختين من الحمض النووي. شريط DNA الأصلي .تُعرف عملية تمسخ الطبيعة، والتليين، والاستطالة عبر سلسلة من درجات الحرارة والأوقات بدورة واحدة من التضخيم (الشكل 1).

يجب تحسين كل خطوة من خطوات الدورة لتناسب القالب ومجموعة التمهيدي المستخدمة.تتكرر هذه الدورة حوالي 20-40 مرة، ويمكن بعد ذلك تحليل المنتج المضخم، عادةً بواسطة هلام الاغاروز (الشكل 2).

وبما أن PCR هو أسلوب حساس للغاية ويتطلب الأمر كميات صغيرة جدًا من التفاعلات الفردية، فمن المستحسن إعداد مزيج رئيسي لعدة تفاعلات.يجب أن يتم خلط المزيج الرئيسي جيدًا ثم تقسيمه حسب عدد التفاعلات، مما يضمن أن كل تفاعل سيحتوي على نفس الكمية من الإنزيم وdNTPs والبادئات.يقدم العديد من الموردين، مثل Enzo Life Sciences، أيضًا مزيجًا من تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي بالفعل على كل شيء باستثناء البادئات وقالب الحمض النووي.

تمثل المناطق الغنية بالجوانين/السيتوزين (الغنية بـ GC) تحديًا في تقنيات PCR القياسية.تعد التسلسلات الغنية بـ GC أكثر استقرارًا من التسلسلات ذات المحتوى المنخفض من GC.علاوة على ذلك، تميل التسلسلات الغنية بـ GC إلى تكوين هياكل ثانوية، مثل حلقات دبوس الشعر.ونتيجة لذلك، يصعب فصل الخيوط المزدوجة الغنية بـ GC بشكل كامل خلال مرحلة تمسخ الطبيعة.ونتيجة لذلك، لا يستطيع بوليميراز الحمض النووي تصنيع الشريط الجديد دون عائق.يمكن أن تؤدي درجة حرارة تمسخ أعلى إلى تحسين هذا، ويمكن للتعديلات نحو درجة حرارة التلدين الأعلى ووقت التلدين الأقصر أن تمنع الارتباط غير المحدد للبادئات الغنية بـ GC.يمكن للكواشف الإضافية أن تعزز تضخيم التسلسلات الغنية بـ GC.يساعد DMSO والجلسرين والبيتين على تعطيل الهياكل الثانوية التي تنتج عن تفاعلات GC وبالتالي تسهيل فصل الخيوط المزدوجة.

بداية ساخنة PCR

التضخيم غير المحدد هو مشكلة يمكن أن تحدث أثناء PCR.تعمل معظم بوليميرات الحمض النووي المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل أفضل عند درجات حرارة تتراوح بين 68 درجة مئوية إلى 72 درجة مئوية.ومع ذلك، يمكن للإنزيم أن يكون نشطًا أيضًا في درجات حرارة منخفضة، ولكن بدرجة أقل.عند درجات حرارة أقل بكثير من درجة حرارة التلدين، يمكن أن ترتبط البادئات بشكل غير محدد وتؤدي إلى تضخيم غير محدد، حتى لو تم إعداد التفاعل على الجليد.يمكن الوقاية من ذلك باستخدام مثبطات البوليميراز التي تنفصل عن بوليميراز الحمض النووي فقط عند الوصول إلى درجة حرارة معينة، ومن هنا يأتي مصطلح البداية الساخنة لـ PCR.يمكن أن يكون المثبط عبارة عن جسم مضاد يربط البوليميراز ويفسد طبيعته عند درجة حرارة التسخين الأولية (95 درجة مئوية نموذجيًا).

بوليميريز عالي الدقة

في حين أن بوليمرات الحمض النووي تتضخم بدقة إلى حد ما إلى تسلسل القالب الأصلي، إلا أنه يمكن أن تحدث أخطاء في مطابقة النوكليوتيدات.يمكن أن يؤدي عدم التطابق في تطبيقات مثل الاستنساخ إلى نسخ مقطوعة، وبروتينات مترجمة بشكل خاطئ أو غير نشطة.ولتجنب عدم التطابق هذا، تم تحديد البوليميرات ذات نشاط "التدقيق اللغوي" ودمجها في سير العمل.تم التعرف على أول بوليميراز تصحيحي، Pfu، في عام 1991 في Pyrococcus furiosus.يحتوي إنزيم Pfu هذا على نشاط نوكلياز خارجي يتراوح من 3 إلى 5 بوصات.عندما يتم تضخيم الحمض النووي، يزيل النيوكلياز الخارجي النيوكليوتيدات غير المتطابقة عند الطرف 3' من الشريط.ثم يتم استبدال النوكليوتيدات الصحيحة، ويستمر تصنيع الحمض النووي.يعتمد تحديد تسلسلات النيوكليوتيدات غير الصحيحة على تقارب الارتباط للنيوكليوسيد ثلاثي الفوسفات الصحيح مع الإنزيم، حيث يؤدي الارتباط غير الفعال إلى إبطاء عملية التوليف ويسمح بالاستبدال الصحيح.يؤدي نشاط التدقيق اللغوي لبوليميراز Pfu إلى أخطاء أقل في التسلسل النهائي مقارنةً ببوليميريز الحمض النووي Taq.في السنوات الأخيرة، تم التعرف على إنزيمات تصحيح التجارب المطبعية الأخرى، وتم إجراء تعديلات على إنزيم Pfu الأصلي لزيادة تقليل معدل الخطأ أثناء تضخيم الحمض النووي.

RT-PCR

يسمح النسخ العكسي PCR، أو RT-PCR، باستخدام الحمض النووي الريبي (RNA) كقالب.خطوة إضافية تسمح بالكشف عن الحمض النووي الريبي (RNA) وتضخيمه.يتم نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل عكسي إلى DNA التكميلي (cDNA)، باستخدام إنزيم النسخ العكسي.تعد جودة ونقاء قالب الحمض النووي الريبي (RNA) ضروريين لنجاح RT-PCR.الخطوة الأولى في RT-PCR هي تخليق هجين DNA/RNA.يحتوي إنزيم النسخ العكسي أيضًا على وظيفة RNase H، التي تؤدي إلى تحلل جزء RNA من الهجين.يتم بعد ذلك إكمال جزيء الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل من خلال نشاط بوليميريز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي للنسخ العكسي إلى cDNA.يمكن أن تؤثر كفاءة رد الفعل الأول على عملية التضخيم.من الآن فصاعدا، يتم استخدام إجراء PCR القياسي لتضخيم [كدنا].إن إمكانية إعادة الحمض النووي الريبي (RNA) إلى [كدنا] بواسطة RT-PCR لها العديد من المزايا، وهي تستخدم في المقام الأول لتحليل التعبير الجيني.الحمض النووي الريبوزي (RNA) أحادي السلسلة وغير مستقر للغاية، مما يجعل العمل معه أمرًا صعبًا.وهو عادة ما يكون بمثابة خطوة أولى في qPCR، الذي يحدد كمية نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) في عينة بيولوجية.

qPCR وRT-qPCR

يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للكشف عن الأحماض النووية وتوصيفها وتحديد كميتها في العديد من التطبيقات.في RT-qPCR، غالبًا ما يتم قياس نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق نسخها العكسي إلى cDNA أولاً، كما هو موضح أعلاه، ثم يتم تنفيذ qPCR لاحقًا.كما هو الحال في PCR القياسي، يتم تضخيم الحمض النووي من خلال ثلاث خطوات متكررة: تمسخ، التلدين، والاستطالة.ومع ذلك، في qPCR، يتيح وضع العلامات الفلورية جمع البيانات مع تقدم PCR.تتمتع هذه التقنية بالعديد من الفوائد بسبب مجموعة الأساليب والكيمياء المتاحة.

في qPCR القائم على الصبغة (الأخضر عادةً)، يسمح وضع العلامات الفلورسنت بقياس جزيئات الحمض النووي المضخمة عن طريق استخدام استخدام صبغة ربط dsDNA.خلال كل دورة، يتم قياس مضان.تزداد إشارة التألق بشكل متناسب مع كمية الحمض النووي المكرر.وبالتالي، يتم قياس كمية الحمض النووي في "الوقت الحقيقي" (الشكل 3).تتمثل عيوب qPCR القائم على الصبغة في أنه يمكن فحص هدف واحد فقط في المرة الواحدة وأن الصبغة سوف ترتبط بأي DNA ds موجود في العينة.

في qPCR القائم على المسبار، يمكن اكتشاف العديد من الأهداف في وقت واحد في كل عينة، ولكن هذا يتطلب تحسين وتصميم مسبار (مسبار) خاص بالهدف يستخدم بالإضافة إلى الاشعال.تتوفر عدة أنواع من تصميمات المسبار، ولكن النوع الأكثر شيوعًا هو مسبار التحلل المائي، والذي يشتمل على فلوروفور ومخمد.يمنع نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) انبعاث الفلوروفور عبر المخمد بينما يكون المسبار سليمًا.ومع ذلك، أثناء تفاعل PCR، يتم تحلل المسبار أثناء تمديد التمهيدي وتضخيم التسلسل المحدد الذي يرتبط به.يفصل انقسام المسبار الفلوروفور عن المخمد وينتج عنه زيادة في التألق تعتمد على التضخيم (الشكل 4).وبالتالي، فإن إشارة الفلورسنت من تفاعل qPCR القائم على المسبار تتناسب مع مقدار تسلسل هدف المسبار الموجود في العينة.نظرًا لأن qPCR القائم على المسبار أكثر تحديدًا من qPCR القائم على الصبغة، فغالبًا ما تكون التكنولوجيا المستخدمة في فحوصات التشخيص المستندة إلى qPCR.

التضخيم متساوي الحرارة

تتطلب تقنيات PCR المذكورة أعلاه معدات تدوير حراري باهظة الثمن لتكثيف درجات حرارة الغرفة لأعلى ولأسفل بدقة لخطوات تمسخ الطبيعة والتليين والتمديد.وقد تم تطوير عدد من التقنيات التي لا تحتاج إلى مثل هذه الأجهزة الدقيقة ويمكن إجراؤها في حمام مائي بسيط أو حتى داخل الخلايا محل الاهتمام.تُسمى هذه التقنيات مجتمعة بالتضخيم متساوي الحرارة وتعمل على أساس التضخيم الأسي أو الخطي أو المتتالي.

النوع الأكثر شهرة من التضخيم متساوي الحرارة هو التضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة، أو LAMP.يستخدم LAMP التضخيم الأسي عند 65 درجة مئوية لتضخيم قالب DNA أو RNA.عند تنفيذ LAMP، يتم استخدام أربعة إلى ستة بادئات مكملة لمناطق الحمض النووي المستهدف مع بوليميراز الحمض النووي لتجميع الحمض النووي الجديد.يحتوي اثنان من هذه البادئات على تسلسلات مجانية تتعرف على التسلسلات في البادئات الأخرى وتربطها، مما يسمح بتكوين بنية "حلقة" في الحمض النووي المركب حديثًا والذي يساعد بعد ذلك على التلدين التمهيدي في جولات تضخيم لاحقة.يمكن تصور LAMP بطرق متعددة، بما في ذلك الفلورسنت، أو الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز، أو قياس الألوان.إن سهولة تصور واكتشاف وجود أو عدم وجود المنتج عن طريق قياس الألوان ونقص المعدات باهظة الثمن المطلوبة جعلت LAMP خيارًا مناسبًا لاختبار SARS-CoV-2 في المناطق التي لم تكن فيها الاختبارات المعملية السريرية متاحة بسهولة، أو تخزين ونقل العينات لم يكن ذلك ممكنًا، أو في المختبرات التي لم يكن بها سابقًا معدات التدوير الحراري لتفاعل البوليميراز المتسلسل.