RNase هي كلمة حساسة لا يرغب العديد من الطلاب الذين يجرون تجارب استخراج الحمض النووي الريبي في سماعها.مسلحًا بالكامل ، تم تحلل الحمض النووي الريبي الذي تم استخراجه أخيرًا بكواشف عالية السمية من الفينول والكلوروفورم.أنا لست متصالحًا!!!اليوم ، دعونا نلقي نظرة على أصل Rnase الشهير.

Ribonuclease (RNase) ، أو RNase ، هو نوكلياز يمكنه تحلل الحمض النووي الريبي إلى جزيئات صغيرة.RNase ، كبروتين جزيئي صغير ، مستقر بشكل غير عادي .لا يمكن للتعقيم التقليدي بالبخار عالي الضغط ودرجات الحرارة المرتفعة ومثبطات البروتين تعطيله تمامًا.يأتي استقرار RNase بشكل أساسي من روابط ثاني كبريتيد في الهيكل.على سبيل المثال ، يحتوي RNase الشائع الاستخدام من البنكرياس البقري على 124 حمض أميني فقط ، ولكنه يحتوي على 4 روابط ثاني كبريتيد.رابطة الكبريت ورابطة ثاني كبريتيد تمنح RNase ثباتًا حراريًا ممتازًا.بالإضافة إلى ذلك ، فإن للـ rnase وزن جزيئي صغير نسبيًا ويمكنه استعادة شكله الأصلي بسرعة في كثير من الحالات.

بالإضافة إلى كونه مستقرًا للغاية ،RNases موجودة في كل مكان في المختبر .RNase هي آلية دفاع بيولوجي.بالنسبة للخلية ، غالبًا ما يكون الحمض النووي الريبي الخارجي قاتلًا.بالمقارنة مع الحمض النووي الخارجي ، غالبًا ما يكون الحمض النووي الريبي الخارجي أكثر خطورة.يتم نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) وترجمته بسعادة ، لذلك طورت جميع الكائنات الحية تقريبًا RNases للدفاع ضد غزو الحمض النووي الريبي الخارجي.لذلك ، فإن الخلايا البكتيرية المزروعة في المختبر وأنت الذي تستخرج الحمض النووي الريبي تنضح برائحة RNase.تحتوي سوائل جسم الإنسان (اللعاب والدموع وما إلى ذلك) على كمية كبيرة من RNase ، لذلك لا تبكي عندما يتحلل الحمض النووي الريبي.كلما بكيت أكثر ، كلما كان تدهور الحمض النووي الريبي أسوأ!!الأخت Daiyu ليست مناسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي!

بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي بشرتك الرقيقة أيضًا على الكثير من RNase ، وتحتوي أيضًا أقلام التحديد ، والماصات ، وأبواب الثلاجة ، ومقابض الأبواب التي لمسها الجلد على RNase.

مع الكثير من التجوال ، دعنا نلقي نظرة على كيفية التعامل مع RNases.

أول شيء يفكر فيه الجميع عند إزالة الحمض النووي الريبي هوDEPC(ثنائي إيثيل بيروكربونات).DEPC يفسد البروتين بشكل أساسي عن طريق الدمج مع حلقة إيميدازول من مجموعة RNase النشطة هيستيدين ، وبالتالي تثبيط نشاط الإنزيم.يمكن أن يكون لـ 0.1 ٪ DEPC تأثير إزالة أفضل على Rnase ، ولكن علينا الانتباه إلى أن DEPC مادة مسرطنة معروفة ، لذلك يجب إيلاء اهتمام خاص عند استخدامه.

بالنسبة إلى RNase ، نحتاج إلى البدء من جانبين ،الأول هو تثبيط نشاط RNase الذاتية

يمكن لكواشف استخراج الحمض النووي الريبي التقليدية مثل إيزوثيوسيانات غوانيدين و DTT الموجودة في Trizol أن تفتح رابطة ثاني كبريتيد RNase ، ولكن لا تزال هناك بعض RNases ، خاصة في عينات الأنسجة ، لذا انتبه إلى درجات الحرارة المنخفضة.

1.اغمر عينة الأنسجة على الفور في النيتروجين السائل بعد إخراجها ، أو في محلول الحفاظ على الحمض النووي الريبي التجاري.

2.بعد استخراج الحمض النووي الريبي لعينة الخلية ، أضفه إلى محلول التحلل وقم بتثبيته على صندوق الثلج

3. من الأفضل استخدام النيتروجين السائل للطحن عندما يتم تجانس عينات الأنسجة.عند استخدام مجانس كهربائي بدون نيتروجين سائل ، انتبه إلى التبريد المسبق الكامل لمحول المجانسة.

والثاني هو DNase خارجي

1.كن مسلحًا بالكامل ، وارتدي معطفًا للمختبر ، وارتدِ قناعًا ، وتأكد من ارتداء زوج من القفازات الجديدة (لا تكن مقتصدًا! وتجدر الإشارة إلى أن Trizol شديد التآكل ، كما أنه قوي جدًا من خلال القفازات ، لذلك لا تقطر على يديك).

2.يجب معالجة جميع أطراف الماصة وأنابيب EP وأنابيب PCR وغيرها من المعدات باستخدام de-RNase.يمكن نقعها في 0.1٪ DEPC ثم ضغطها تحت ضغط مرتفع.انتبه إلى العملية في غطاء الدخان.يمكن للطغاة المحليين شراء المواد الاستهلاكية مباشرة لإزالة الإنزيمات.

ملاحظة: دعني أخبرك بطريقة كسولة.على الرغم من أن ارتفاع درجة الحرارة والضغط العالي لا يمكن أن يزيلا RNase تمامًا ، إلا أنه سيزيل جزءًا كبيرًا منه.2 مرات من ارتفاع درجة الحرارة والضغط العالي له تأثير جيد ، واستخراج الحمض النووي الريبي له تأثير ضئيل.

3.يمكن للكحول أن يفسد البروتينات ،لذلك يمكن مسح طاولة استخراج الحمض النووي الريبي مع 75٪ كحول ، ويمكن أيضًا رش القفازات بالكحول.

4.يجب أيضًا معالجة محلول حل الحمض النووي الريبي النهائي وأنبوب الطرد المركزي.ماء DEPC هو محلول تذويب RNA شائع الاستخدام.دعنا نتحدث عن طريقة التحضير الصحيحة لمياه DEPC (تذكر إعادة تغليف DEPC التجاري عند شرائه)

أضف DEPC إلى الماء عالي النقاوة عند 1: 1000 ، ورج جيدًا ، واتركه طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، وقم بالتعقيم عند 121 درجة مئوية تحت درجة حرارة عالية وضغط مرتفع لمدة 15 دقيقة.يمكن تخزين مياه DEPC عند -20 درجة مئوية في قسامات 1 مل.

أخيرًا ، للتلخيص: درجة الحرارة المنخفضة هي المفتاح ، يتم التعامل مع المواد الاستهلاكية جيدًا ، ومسلحة بالكامل وأقل كلامًا!

حسنًا ، هذا كل شيء بالنسبة لاستراتيجية اليوم.أتمنى لك كل تركيز RNA والنقاء الذي ذكرته.كلاهما A260 / A280 2.0!!!

بالطبع ، إذا كنت تستخدم ملفطقم استخراج الحمض النووي الريبي عملية درجة حرارة الغرفة، قد لا تواجه المشاكل المذكورة أعلاه.

العملية في درجة حرارة الغرفة ، دون إضافة DNase ، تستخلص الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا في 11 دقيقة ، وتستخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من الأنسجة الحيوانية أو النباتات في 30 دقيقة.

للحصول على عينات تجريبية ، يرجى الاتصال بـ:overseas@foregene.com

منتجات ذات صله:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/