Real Time PCR ، المعروف أيضًا باسم PCR الكمي أو qPCR ، هو طريقة للمراقبة في الوقت الفعلي وتحليل منتجات تضخيم PCR.
نظرًا لأن PCR الكمي يتميز بمزايا التشغيل البسيط ، والسريع والمريح ، والحساسية العالية ، والتكرار الجيد ، ومعدل التلوث المنخفض ، فإنه يستخدم على نطاق واسع في الاختبارات الطبية ، وتقييم فعالية الأدوية ، وأبحاث التعبير الجيني ، والبحوث المعدلة وراثيا ، واكتشاف الجينات ، واكتشاف مسببات الأمراض ، والكشف عن الحيوانات والنباتات.واختبار الأغذية وغيرها من المجالات.
لذلك ، سواء كنت منخرطًا في البحوث الأساسية في علوم الحياة ، أو موظفين في شركات الأدوية ، أو شركات تربية الحيوانات ، أو شركات الأغذية ، أو حتى موظفي تفتيش الدخول والخروج ومكاتب الحجر الصحي ، وأقسام المراقبة البيئية ، والمستشفيات والوحدات الأخرى ، فستكون أكثر أو أقل عرضة أو تحتاج إلى معرفة إتقان PCR الكمي.

مبدأ الوقت الحقيقي PCR

Real Time PCR هي طريقة يتم فيها إضافة المواد الفلورية إلى نظام تفاعل PCR ، ويتم مراقبة كثافة إشارة التألق في عملية تفاعل PCR في الوقت الفعلي بواسطة أداة PCR الكمية ، وفي النهاية يتم تحليل البيانات التجريبية ومعالجتها.

【منحنى التضخيم】هو المنحنى الذي يصف العملية الديناميكية لـ PCR.منحنى التضخيم لـ PCR ليس في الواقع منحنى أسيًا قياسيًا ، ولكنه منحنى سيني.

[مرحلة المنصة لمنحنى التضخيم]مع زيادة عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتعطيل بوليميراز الحمض النووي ، واستنفاد dNTPs والبادئات ، وتثبيط تفاعل التوليف بواسطة تفاعل المنتج الثانوي بيروفوسفات ، وما إلى ذلك ، لا يتوسع PCR دائمًا بشكل كبير.، وسيدخل في النهاية هضبة.

[منطقة النمو الأسي لمنحنى التضخيم]على الرغم من أن مرحلة الهضبة تختلف اختلافًا كبيرًا ، في منطقة معينة من منطقة النمو الأسي لمنحنى التضخيم ، فإن التكرار جيد جدًا ، وهو أمر مهم جدًا للتحليل الكمي لـ PCR.

[قيمة العتبة وقيمة Ct]قمنا بتعيين القيمة الحدية لاكتشاف التألق في الموضع المناسب في منطقة النمو الأسي لمنحنى التضخيم ، أي قيمة العتبة (العتبة).تقاطع قيمة العتبة ومنحنى التضخيم هو قيمة Ct ، أي أن قيمة Ct تشير إلى عدد الدورات (دورة العتبة) عند الوصول إلى قيمة العتبة.

يوضح الرسم البياني أدناه بوضوح العلاقة بين خط العتبة ومنحنى التضخيم والعتبة وقيمة Ct.

【كيف تقاس؟】

لقد أثبتت النظرية الرياضية أن قيمة Ct لها علاقة خطية عكسية مع لوغاريتم عدد القوالب الأولية.يراقب PCR في الوقت الحقيقي منتجات تضخيم PCR في الوقت الفعلي ويحددها خلال مرحلة التضخيم الأسي.

لكل دورة من PCR ، زاد الحمض النووي أضعافا مضاعفة ، وسرعان ما وصل إلى الهضبة.

بافتراض أن مقدار بدء الحمض النووي هو أ₀ ، بعد دورات n ، يمكن التعبير عن الكمية النظرية لمنتج DNA على النحو التالي:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

ثم ، كلما زادت كمية الحمض النووي الأولية A 0 ، كلما وصلت كمية المنتج المضخم إلى قيمة الاكتشاف A ، وعدد الدورات عند الوصول إلى An هو قيمة Ct.أي أنه كلما زادت كمية الحمض النووي الأولية A 0 ، كلما كان منحنى التضخيم مبكرًا ، وبالمقابل يكون العدد المطلوب من الدورات n أصغر.

نقوم بتنفيذ التخفيف التدريجي لمعيار التركيز المعروف ونستخدمه كقالب لـ Real Time PCR ، وسيتم الحصول على سلسلة من منحنيات التضخيم على فترات متساوية بترتيب بدء كمية الحمض النووي من أكثر إلى أقل.وفقًا للعلاقة الخطية بين قيمة Ct ولوغاريتم عدد قوالب البداية ، أيمكن إنشاء [منحنى قياسي].

من خلال استبدال قيمة Ct للعينة بتركيز غير معروف في المنحنى القياسي ، يمكن الحصول على كمية القالب الأولية للعينة ذات التركيز غير المعروف ، وهو المبدأ الكمي لـ Real Time PCR.

طريقة الكشف عن الوقت الحقيقي PCR

يكتشف Real Time PCR منتجات تضخيم PCR عن طريق الكشف عن شدة التألق في نظام التفاعل.

مبدأ طريقة تضمين صبغة الفلورسنت】

الأصباغ الفلورية، مثل TB Green ® ، يمكن أن يرتبط بشكل غير محدد بالحمض النووي مزدوج الشريطة في أنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسل ويتألق عند الربط.

زادت شدة التألق في نظام التفاعل بشكل كبير مع زيادة دورات PCR.من خلال الكشف عن شدة التألق ، يمكن مراقبة كمية تضخيم الحمض النووي في نظام التفاعل في الوقت الفعلي ، ومن ثم يمكن تقدير كمية نموذج البداية في العينة بشكل عكسي.

【مبدأ طريقة مسبار الفلورسنت】

مسبار الفلورسنتعبارة عن تسلسل الحمض النووي مع مجموعة الفلورسنت في نهاية 5 ومجموعة التبريد في الطرف 3 ، والتي يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالقالب.عندما يكون المسبار سليمًا ، فإن الفلورة المنبعثة من الفلوروفور يتم إخمادها بواسطة مجموعة التبريد ولا يمكن أن تتألق.عندما يتحلل المسبار ، سوف تنفصل مادة الفلورسنت وتنبعث منها الفلورة.

يضاف مسبار الفلورسنت إلى محلول تفاعل PCR.أثناء عملية التلدين ، سوف يرتبط مسبار الفلورسنت بالموضع المحدد للقالب.أثناء عملية التمديد ، يمكن لنشاط نوكلياز خارجي 5 → 3 من إنزيم PCR تحلل مسبار الفلورسنت المهجن بالقالب ، ويتم فصل مادة الفلورسنت لإصدار الفلورة.من خلال الكشف عن شدة التألق للمسبار في نظام التفاعل ، يمكن تحقيق الغرض من مراقبة كمية التضخيم لمنتج PCR.

【اختيار طريقة الكشف عن الأسفار】

إذا تم استخدامه لتمييز التسلسلات ذات التماثل العالي وإجراء اكتشاف PCR متعدد مثل تحليل كتابة SNP ، فإن طريقة مسبار الفلورسنت لا يمكن الاستغناء عنها.
بالنسبة لتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الأخرى ، يمكن استخدام طريقة الوهم الفلورية البسيطة والسهلة ومنخفضة التكلفة.

تحقيقات نوعية قوية ، قادرة على تعدد إرسال PCR

عيب

متطلبات خصوصية عالية للتضخيم ؛

لا يمكن إجراء PCR متعدد الإرسال الحاجة إلى تصميم تحقيقات محددة ، تكلفة عالية ؛

في بعض الأحيان يكون تصميم المجس صعبًا

منتجات ذات صله: