RT-qPCR هي التجربة الأساسية للبيولوجيا الجزيئية ، ويجب أن يكون الجميع على دراية بها.يتضمن بشكل أساسي ثلاث خطوات: استخراج الحمض النووي الريبي ، والنسخ العكسي إلى (كدنا) ، و PCR الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي.ما الذي يحدث؟من المحتمل أن تكون هناك مشكلة فيتجربة النسخ العكسي!على الرغم من أنه يبدو أن تجربة النسخ العكسي تحتاج فقط إلى إضافة RNA و dNTP و primers والنسخ العكسيإلى أنبوب الطرد المركزي واخلطه جيدًا ، ولكن في عملية التشغيل الفعلية ، لا يزال هناك العديد من التفاصيل التي يجب الانتباه إليها.دعنا نتعلم عنها!

كيف نحكم على جودة الحمض النووي الريبي؟
للحصول على (كدنا) ، فإن جودة الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية!يمكن اكتشاف جودة الحمض النووي الريبي بشكل أساسي من جانبين:
(1) سلامة الحمض النووي الريبي:يمكن التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. إذا أخذنا حقيقيات النوى كمثال ، فإن إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) يحتوي على ثلاثة نطاقات واضحة ، والأوزان الجزيئية من الكبيرة إلى الصغيرة هي 28S ، و 18 S ، و 5 S ، و 28 S ضعف سطوع 18S ؛إذا كان من الممكن رؤية ثلاثة نطاقات ، لكن نوع النطاق غير واضح أو يعني الانتشار أن الحمض النووي الريبي يتحلل جزئيًا.في هذا الوقت ، يرجى إجراء رد فعل النسخ العكسي على الفور وزيادة إدخال النموذج بشكل مناسب ؛إذا كان يمكن رؤية شريط بوزن جزيئي صغير فقط أو لا يوجد شريط ، فإن الحمض النووي الريبي قد تدهور تمامًا ويحتاج إلى إعادة استخراجه.يشير Agilent 2100 إلى تكامل الحمض النووي الريبي مع مخطط الذروة وقيمة RIN.إذا كان الحمض النووي سليمًا ، يكون خط الأساس للمخطط الكهربائي مسطحًا ؛إذا كان الحمض النووي متحللاً بشدة ، فإن خط الأساس غير متساو ويظهر المزيد من قمم التحلل ؛تعكس قيمة RIN سلامة الحمض النووي الريبي ، في نطاق 0-10 ، فكلما زادت القيمة ، كانت جودة الحمض النووي الريبي أفضل.حسنًا ، كلما زادت درجة الاكتمال.
(2) نقاء الحمض النووي الريبي (RNA):يمكن الكشف عن نسبة OD260 / 280 بواسطة قياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية.إذا كانت نسبة OD260 / 280 بين 1.9 و 2.1 ، فإن النقاوة تكون جيدة جدًا.
يمكن أن يؤدي الحمض النووي الجيني المتبقي إلى نتائج كمية غير دقيقة
عندما يتم استخراج الحمض النووي الريبي ، قد يتم خلط الحمض النووي الريبي الذي نحصل عليه مع الحمض النووي الجيني (gDNA) الذي لم يتم تنظيفه.لذلك ، سيتم أيضًا خلط cDNA بعد النسخ العكسيجدنا.أثناء المصبqPCRرد فعل،كدنايمكن تضخيم و gDNA في وقت واحد ، مما يؤدي إلى قيمة CT صغيرة نسبيًا ، لذلك قد تكون النتائج متحيزة.
إذن ماذا يجب أن نفعل في هذه الحالة؟فورجينوتقترح:
(1) إجراء تنظيف الجينوم على الحمض النووي الريبي المعكوس ، والذي يمكن إزالته عن طريق استخراج العمود أثناء استخراج الحمض النووي الريبي ؛
(2) علاج الحمض النووي الريبي المستخرج مع الدنازI ، ولكن قم بإنهائه باستخدام EDTA ؛
من كواشف النسخ العكسيمع وحدات إزالة الجينوم ؛

كيف تختار الاشعال للنسخ العكسي؟
يؤثر النسخ العكسي التمهيدي أيضًا على نتيجة تفاعل النسخ العكسي.يمكنك اختيار مواد أولية عشوائية أو Oligo dT أو بادئات خاصة بالجينات للنسخ العكسي وفقًا للظروف المحددة للتجربة:
(1) نصوص محددة: يوصى باستخدام مواد أولية خاصة بالجينات ؛
(2) نصوص طويلة: يوصى باستخدام البادئات Oligo dT / الخاصة بالجينات ؛
(3) الأجزاء الداخلية لنصوص المقاطع الطويلة: الاشعال الخاصة بالجينات / الاشعال العشوائي / الاشعال العشوائي + Oligo dT.إذا تم إجراء تجربة qPCR اللاحقة ، فلا يمكن استخدام Oligo dT بمفرده ، لأن استخدام Oligo dT وحده قد يتسبب في انحياز 3 end ، مما يؤدي إلى نتائج تجربة qPCR غير دقيقة ؛
(4) ميرنا: يمكن استخدام البادئات ذات الحلقة الجذعية أو البادئات المتخلفة.

كم مرة يجب تخفيف منتج النسخ العكسي (كدنا) للتقدير الكمي؟
بعد الحصول على (كدنا) لمنتج النسخ العكسي ، كم مرة يجب تخفيف (كدنا) لتجارب qPCR مهم جدا.إذا كان تركيز (كدنا) مرتفعًا جدًا أو منخفضًا جدًا ، فقد تتأثر كفاءة التضخيم.هل يمكن قياس تركيز (كدنا) وكيف يتم ذلك؟
(1) لا يمكن قياس تركيز (كدنا) لمنتج النسخ العكسي ، لأنه بالإضافة إلى منتج (كدنا) ، فإن منتج النسخ العكسي يحتوي أيضًا على النسخ العكسي المتبقية المخزن المؤقت ، النسخ العكسي ، الاشعال ، وما إلى ذلك ، والتي سوف تتداخل مع نتائج قياس التركيز وتتسبب في نسبة OD260 / 280 ، OD260 / 230 غير طبيعية وبالتالي لا تعكس عائد cDNA الحقيقي.في هذا الوقت ، سيقول بعض الأصدقاء ، سأقيس التركيز بعد التطهير ؛هنا ، تود Foregene أن تذكر أن (كدنا) لا ينصح بتنقيته ، لأن طول الـ (كدنا) الذي تم الحصول عليه عن طريق الانعكاس مختلف ، وسوف يضيع (كدنا) القصير في التنقية.
(2) إذن ماذا تفعل؟قبل تجربة qPCR ، يمكن تحديد تدرج التخفيف من [كدنا] من خلال التجربة السابقة.على سبيل المثال: استخدم محلول مخزون cDNA ، والتخفيف 10 أضعاف ، والتخفيف 100 ضعف كقوالب لتجارب qPCR ، وحدد عامل التخفيف بقيمة CT في نطاق 18-28.

كيف ينبغي نسخ ميرنا عكسيًا؟
ميرنا عبارة عن جزيء صغير من الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة يبلغ حجمه حوالي 22 نانو طنًا ولا يرمز إلى البروتين.نظرًا لقصر طولها ، يصعب تحديد طريقة qPCR التقليدية بشكل مباشر ، لذلك غالبًا ما يكون من الضروري تمديد miRNA ؛تتضمن طرق النسخ العكسي المستخدمة بشكل شائع لـ miRNA طريقة الحلقة الجذعية وطريقة الذيل.
تتمثل طريقة الحلقة الجذعية في تمديد ميرنا عن طريق إضافة بادئات الحلقة الجذعية.تتميز طريقة الكشف هذه بحساسية وخصوصية أعلى ، لكن معدل نقل الكشف منخفض.يمكن للنسخ العكسي واحد فقط اكتشاف ميرنا واحد ومرجع داخلي ؛تتكون طريقة إضافة الذيل من اثنين ، وتكتمل من خلال العمل المشترك لإنزيمين ، وهما بوليميراز بوليميراز ونسخة عكسية.بوليميراز PolyA هو المسؤول عن إضافة ذيول PolyA إلى miRNA لزيادة طوله ، وينفذ النسخ العكسي تفاعل النسخ العكسي.تتميز هذه الطريقة بإنتاجية عالية للكشف ويمكنها اكتشاف العديد من الجزيئات الدقيقة والمراجع الداخلية في نسخ عكسي واحد ، ولكن الحساسية والنوعية منخفضة في طريقة الحلقة الجذعية.