يتحدث الجميع عن مبدأ تجربة qRT-PCR ، والتصميم التمهيدي ، وتفسير النتائج ، وما إلى ذلك ، ولكن أعتقد أنه ينبغي أن أشارككم العملية التجريبية لـ qRT-PCR.إنه صغير ، لكنه يتعلق بالنتائج.

قبل إجراء qRT-PCR ، نحتاج إلى فهم واضح للحمض النووي الريبي الخاص بنا وطرق التشغيل.بعد كل شيء ، تهدف جهودنا إلى الحصول على النتائج ، وليس مجرد الممارسة.لذلك قبل إجراء qRT-PCR ، نحتاج إلى تحديد المشكلات التالية (بعضها ينطبق فقط على SYBR).

1 هل أنت متأكد من أن الحمض النووي الريبي الخاص بك لا يتحلل؟

يمكن لـ NanoDrop 2000 فقط اكتشاف تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي ، ولكن لا يمكنه اكتشاف سلامة الحمض النووي الريبي.

يمكن أن تعكس قيمة RNA (RNA Intesity Number) سلامة الحمض النووي الريبي (RNA) ، والذي تم الكشف عنه بواسطة نظام Agilent 2100 Bioanalyzer.

الشكل. رسم تخطيطي لقيم RIN لعينات مختلفة من الحمض النووي الريبي (حقيقيات النوى)

ومع ذلك ، لا تحتوي المختبرات بشكل عام على Agilent 2100 Bioanalyzer.في هذه الحالة ، يمكننا الكشف عن طريق هلام الفورمالديهايد ، ولكن متطلبات الكمية الإجمالية للحمض النووي الريبي مرتفعة ، لذا فإن الطريقة الأسرع هي استخدام الرحلان الكهربائي للهلام العادي.يجب أن تكون في بيئة خالية من نوكلياز ، لذلك من الضروري شطف خزان الرحلان الكهربائي وزجاجة سول وكتيفة الهلام والمشط بماء DEPC.كما أن الاغاروز خالي من نوكلياز (طالما تم فتحه حديثًا) ، ويجب فتح مخزن التحميل حديثًا قدر الإمكان ، مع هلام بنسبة 1.2٪.

لاحظ أنه يجب إذابة الهلام تمامًا ، وإلا فإنه سيتسبب في نطاقات غير متجانسة ، كما هو موضح في العينة 9 في الشكل.إذا كان الجهد مرتفعًا جدًا أو يعمل لفترة طويلة جدًا ، فسوف يولد حرارة ويسبب تدهور الحمض النووي الريبي ، لذلك يجب التحكم في الجهد والوقت بشكل معقول.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يحدد تشغيل الهلام أيضًا ما إذا كانت هناك بقايا DNA في العينة ، ومراقبة ما إذا كان هناك عدد كبير من العصابات المحتجزة في بئر الاستغناء.

شكل.الكشف عن الرحلان الكهربي للهلام من الحمض النووي الريبي

2 هل أنت متأكد من تركيز [كدنا] الخاص بك؟

تجربة الأخوة الكبار في المختبر هي أن cDNA لنظام 20 ul الذي تم الحصول عليه عن طريق كل انعكاس يتم تخفيفه بشكل مباشر 20X ، في حين يتم تخفيف أخوات ما بعد الدكتوراه 10 X.عادة ما أعتمد على الموقف.نظرًا لاختلاف جودة الحمض النووي الريبي الذي يذكره كل شخص ، يختلف مستوى الانعكاس أيضًا ، وقد لا تكون تقنية الانعكاس مستقرة.

لذلك في كل مرة أحصل على cDNA المعكوس ، سأخففه أولاً حوالي 3 مرات ، ثم استخدم جين التدبير المنزلي للقيام بـ RT-PCR ، يكون عدد الدورات عمومًا 25 دورة ، لتحديد التركيز المحدد ، ثم تحديد عامل التخفيف النهائي.

3 هل أنت متأكد من أن البرايمر سهل الاستخدام؟

يمكنه اجتياز منحنى الانصهار لـ qRT-PCR ، لكن هذا لا يزال يكلف المال.بالنسبة للمختبرات التي ليس لديها الكثير من المال ، عندما تحصل على الكثير من المواد الأولية ، يمكنهم استخدام RT-PCR العادي لمعرفة ما إذا كان نطاقًا واحدًا وتحديد خصوصية البادئات.إذا لم يكن المختبر يعاني من نقص في المال ، فيمكن تحديد خصوصية جميع البادئات مرة واحدة من خلال منحنى الذوبان.

4 هل أنت متأكد من أن ظروفك التجريبية مناسبة؟

يجب حماية SYBR من الضوء القوي ، لذا حاول إطفاء الضوء العلوي عند إضافة كاشف SYBR ، وتحتاج فقط إلى استخدام الضوء الخافت لإكماله.

تخزين SYBR في 4 درجات مئوية.عند الاستخدام ، اقلبها لأعلى ولأسفل برفق للخلط جيدًا لتجنب الرغوة ، ولا تقم بالدوامة بقوة.

تحب بعض الأخوات الأصغر سنًا رسم علامات على لوحة PCR خوفًا من خلط العينات ، وهذا خطأ.نظرًا لأنه من المحتمل جدًا أن تؤثر علاماتك على مجموعة إشارات الفلورسنت ، فإنني أوصي بشكل عام الصغار باستخدام دفاتر ملاحظات تجريبية للمساعدة في الذاكرة ، كما هو موضح أدناه.

شكل.مخطط تحميل عينة qRT-PCR

5 هل أنت متأكد أنك تفعل ذلك بشكل صحيح؟

تأكد من ارتداء القفازات ، وارتداء القفازات ، وارتداء القفازات ، وقول أشياء مهمة ثلاث مرات.

من أجل تقليل تعرض SYBR للضوء ، أود شخصياً إضافة قالب أولاً ، كما هو موضح في الشكل أدناه.وفقًا للتجربة ، من المحتمل أن تتسبب إضافة كمية صغيرة من النموذج في حدوث أخطاء في أخذ العينات.لذلك ، لتقليل الخطأ الناتج عن إضافة كمية صغيرة من القالب ، عادةً ما أضاعف العينة مرة أخرى ، ومضاعفة الكمية عند إضافة العينة لتقليل كمية H2O2 المضافة.

شكل.رسم تخطيطي لتحميل qRT-PCR

ثم قم بتكوين نظام qRT-PCR على النحو التالي.

شكل.مخطط إعداد نظام qRT-PCR

ملاحظة: يجب إجراء عملية التكوين على الجليد.

بعد إضافة العينة ، قم بلصق فيلم الختم الشفاف.حاول ألا تلمس سطح فيلم الختم الشفاف بيديك ، فقط قم بتشغيله من المساحة على جانبي الفيلم.لأن بصمات الأصابع قد تؤثر أيضًا على تجميع إشارات الفلورسنت.ثم استخدم جهاز طرد مركزي للطرد المركزي بسرعة لمدة 10 ثوانٍ بسرعة منخفضة لمنع العينة من التعليق على الحائط.

منتجات ذات صله:

عدة الخلية المباشرة RT-qPCR

RT سهل II