خصوصية الكشف

في معظم الحالات ، يكون الغرض من تصميم التمهيدي هو تعظيم خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل.يتم تحديد ذلك من خلال التأثير المتوقع إلى حد ما للعديد من المتغيرات.أحد المتغيرات المهمة هو التسلسل في 3′ نهاية التمهيدي.

الأهم من ذلك ، من المرجح أن تحافظ فحوصات PCR المصممة للخصوصية على كفاءة عالية على مدى ديناميكي واسع ، لأن الفحص لا ينتج منتجات تضخيم غير محددة ، وبالتالي يتنافس مع كواشف PCR أو يثبط تفاعل التضخيم الرئيسي.

بالطبع ، في بعض الحالات ، لا تكون الخصوصية هي الأكثر أهمية ، على سبيل المثال ، عندما يكون الهدف هو تحديد العوامل المرضية المرتبطة ارتباطًا وثيقًا ولكن يلزم وجود معايير خاصة بالتصميم والتحسين والتحقق.

منحنى الذوبان هو طريقة قياسية لتقييم خصوصية الأمبليكون ، على الأقل من حيث ما إذا كان سيتم تضخيم هدف واحد.ومع ذلك ، يجب التأكيد على أن منحنيات الانصهار يمكن أن تكون مضللة لأنها ، على سبيل المثال ، يمكن أن تتأثر بالتأثيرات المجمعة للبادئات دون المستوى الأمثل وتركيزات القالب المنخفضة.

P5 |يوضح منحنى الانصهار تحولات Tm التي تم الحصول عليها من اكتشافين لكميات مختلفة من اثنين من الحمض النووي المستهدف.

ج. بتركيزات أعلى (إعلان)) ، لا يوجد دايمر تمهيدي واضح بعد اكتمال قياس qPCR.نظرًا لانخفاض تركيز القالب إلى 50 نسخة (هـ) ، يبدأ منتج غير محدد في الظهور ويصبح المنتج الوحيد عند أدنى تركيز (f).

سجل الاختبار نفس Tms في جميع التركيزات المستهدفة ، ولم يكن هناك دايمر أولي واضح حتى عند أقل تركيز (5 نسخ).عند استخدام هاتين الطريقتين للكشف ، لم يتم اكتشاف أي منتجات تضخيم في NTCs.

يوضح P5 منحنيات الذوبان التي تم الحصول عليها من العينات التي يوجد فيها القالب بتركيزات مختلفة.يوضح P 5a أنه عند أدنى تركيزين ، فإن Tms لمنتجات التضخيم غير المحددة المنتجة أقل من تلك الخاصة بالأمبليكون المحدد.

من الواضح أن طريقة الكشف هذه لا يمكن استخدامها بشكل موثوق لاكتشاف الأهداف الموجودة بتركيزات منخفضة.

ومن المثير للاهتمام ، أن NTCs ، أي العينات التي لا تحتوي على DNA على الإطلاق ، لم تسجل منتجات تضخيم (غير محددة) ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الجيني في الخلفية يمكن أن يشارك في التضخيم / البلمرة غير المحدد.

في بعض الأحيان ، لا يمكن معالجة مثل هذه الاشعال الخلفية والتضخيم غير المحدد ، ولكن غالبًا ما يكون من الممكن تصميم طريقة كشف لا تحتوي على تضخيم غير محدد في أي تركيز للقالب و NTC (P 5b).

هنا ، حتى تسجيل تضخيم التركيز المستهدف باستخدام Cq 35 سينتج منحنى انحلال محدد.وبالمثل ، لم تظهر NTCs أي علامات تضخيم غير محدد.في بعض الأحيان ، قد يعتمد سلوك الكشف على السائل الأم ، ويتم اكتشاف التضخيم غير المحدد فقط في بعض التركيبات العازلة ، والتي قد تكون مرتبطة بتركيزات Mg2 + المختلفة.

استقرار الكشف

يعد تحسين Ta خطوة مفيدة في عملية التحقق التجريبي والتحسين لاكتشاف qPCR.يوفر مؤشرًا مباشرًا لمتانة مجموعة التمهيدي من خلال إظهار درجة الحرارة (أو نطاق درجة الحرارة) التي تنتج أقل Cq دون تضخيم NTC.

قد لا يكون الاختلاف في الحساسية من ضعفين إلى أربعة أضعاف مهمًا للأشخاص الذين لديهم تعبير عالي من الرنا المرسال ، ولكن بالنسبة للاختبارات التشخيصية ، فقد يعني ذلك الفرق بين النتائج السلبية الإيجابية والنتائج الخاطئة.

قد تختلف خصائص Ta من بادئات qPCR بشكل كبير.بعض الاختبارات ليست قوية للغاية ، وإذا لم يتم إجراؤها تحت قيمة Ta المثلى للبادئات ، فسوف تنهار بسرعة.

هذا مهم لأن هذا النوع من الاكتشاف غالبًا ما يمثل مشكلة في العالم الحقيقي ، وقد لا يكون نقاء العينة أو تركيز الحمض النووي أو وجود الحمض النووي الآخر هو الأمثل.

بالإضافة إلى ذلك ، قد يختلف رقم النسخة المستهدفة في نطاق واسع ، وقد تختلف الكواشف أو الأواني البلاستيكية أو الأدوات عن تلك المستخدمة عند إعداد الاختبار.

P6 | يُظهر تدرج درجة الحرارة المتانة المختلفة للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل.

A. استخدم Bioline Sensifast SYBR mastermix (رقم الكتالوج BIO-98050) لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على (كدنا) المحضر من الحمض النووي الريبي للدماغ البشري.

ب. استخدم أداة CFX qPCR من Bio-Rad لتسجيل خريطة التضخيم ومنحنى انحلال الأبالين (NM_033207 ، F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC ، R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

ج- الرسم البياني التضخمي ومنحنى الانصهار لـ ACSBG1 (NM_015162.4 ، F: CTACACTTCCGGCACCACTGG ، R: GTCCACGTGATTGTCTTGACTCAG).

D. التضخيم الرسم البياني ومنحنى انحلال GFAP (NM_002055.5 ، F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG ، R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

تم تسجيل E. Cqs في درجات حرارة تلدين مختلفة ، مما يدل على الفرق في Cq المسجل تحت تدرج درجة حرارة 7C.

يُظهر P 6 نتيجة نموذجية لاختبار غير مرغوب فيه ، حيث تم إجراء qPCR باستخدام تدرج Tas بين 59 درجة مئوية و 67 درجة مئوية (P 6a) ، باستخدام بادئات لثلاثة جينات خاصة بالدماغ البشري.

يمكن أن نرى من الرسم البياني للتضخيم أن بادئات Opalin بعيدة كل البعد عن المثالية لأن نطاقها الأمثل Ta ضيق للغاية (الشكل 6 ب) ، أي أن Cqs مشتتة على نطاق واسع ، مما أدى إلى مقارنة Cqs بشكل كبير مع Cqs الأمثل.

طريقة الكشف هذه غير مستقرة وقد تؤدي إلى تضخيم دون المستوى الأمثل.لذلك ، يجب إعادة تصميم هذا الزوج من البادئات.بالإضافة إلى ذلك ، يوضح تحليل منحنى الانصهار (الشكل الداخلي) أن خصوصية طريقة الكشف هذه قد تكون مشكلة أيضًا ، لأن منحنى الذوبان لكل Ta مختلف.

تعد طريقة الكشف عن ACSBG1 الموضحة في P 6c أكثر قوة من طريقة الكشف عن Opalin أعلاه ، ولكنها لا تزال بعيدة عن المثالية ، ومن المحتمل أنه يمكن تحسينها.

ومع ذلك ، فإننا نؤكد أنه لا توجد علاقة ضرورية بين المتانة والخصوصية ، لأن منحنى الذوبان الناتج عن طريقة الكشف هذه يظهر نفس قيمة الذروة في جميع Tas (أقحم).

من ناحية أخرى ، يكون اختبار المتانة أكثر تسامحًا ، حيث ينتج عنه Cqs متشابهة في نطاق واسع من Tas ، كما هو الحال في اختبار GFAP الموضح في P 6d.

الفرق في Cqs التي تم الحصول عليها في نفس نطاق 8 درجات مئوية أقل من 1 ، ويؤكد منحنى الذوبان (داخلي) خصائص الكشف في نطاق درجة الحرارة هذا.تجدر الإشارة إلى أن Tas المحسوب ونطاق Ta الفعلي قد يكونان مختلفين تمامًا.

هناك العديد من الإرشادات المصممة لمساعدة الباحثين على تصميم مواد أولية فعالة ، يعتمد معظمها على قواعد راسخة منذ فترة طويلة وقد تم إيلاء الكثير من الاهتمام للنهاية الثالثة للبادئات.يوصى غالبًا بتضمين G أو C عند الطرف 3 وقاعدتين G أو C (مشبك GC) ، ولكن ليس أكثر من قاعدتين من القواعد الخمس الأخيرة.

في الممارسة العملية ، يمكن لهذه القواعد أن توجه الباحثين ، لكنها ليست بالضرورة صحيحة في جميع الظروف.

P7 |3′ نهاية التمهيدي لها تأثير ضئيل على الخصوصية أو الكفاءة.

أ. موضع البادئات لجين HIF-1α البشري (NM_181054.2).

ب. استخدم الخمور الأم Agilent Brilliant III SYBR Green (Cat. رقم 600882) لتضخيم ستة عناصر اختبار.

ج- الرسم البياني للتضخيم ومنحنى الانصهار المسجل بواسطة أداة CFX qPCR من Bio-Rad و 3′ نهايات الاشعال.يتم عرض NTCs باللون الأحمر.

سجل د. Cqs لكل عنصر اختبار

على سبيل المثال ، النتيجة في P 7 تتعارض مع قاعدة 3′end.تنتج جميع التصميمات نفس النتائج بشكل أساسي ، مع وجود مجموعتين فقط من البادئات تؤدي إلى تضخيم غير محدد في NTC.

ومع ذلك ، لا يمكننا دعم تأثير مقطع GC ، لأنه في هذه الحالة ، لا يؤدي استخدام A أو T كحد أقصى 30 قاعدة إلى تقليل الخصوصية.

قام الاختبار C ، حيث ينتهي التمهيدي F في GGCC ، بتسجيل Cqs في NTCs ، مما يشير إلى أنه قد يرغب المرء في تجنب هذه التسلسلات في الطرف 30.نؤكد أن الطريقة الوحيدة لتحديد أفضل تسلسل ثلاثي نهاية لزوج تمهيدي هي تقييم بعض البادئات المرشحة تجريبياً.

كفاءة التضخيم

الأهم من ذلك ، على الرغم من أن الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المحدد لا يمكن أبدًا أن يصبح محددًا ، يمكن تعديل كفاءة التضخيم وتعظيمها بعدة طرق مختلفة عن طريق تغيير الإنزيم ، والسائل الأم ، والإضافات ، وظروف التدوير.

لتقييم كفاءة اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الأفضل استخدام تخفيف متسلسل يبلغ 10 أو 5 أضعاف الحمض النووي المستهدف ، أي "طريقة المنحنى القياسية".

إذا تم استخدام أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل أو أهداف الحمض النووي الاصطناعية لتوليد منحنى قياسي ، فيجب خلط التخفيفات التسلسلية لهذه الأهداف بكمية ثابتة من الحمض النووي في الخلفية (مثل الحمض النووي الجيني).

P8 |منحنى التخفيف لتقييم كفاءة PCR.

أ. استخدم البرايمر لـ HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA و R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC و Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (رقم الكتالوج 600882) لظروف منحنى الذوبان و PCR.

تم نسخ B. 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي ، وتم تخفيفه مرتين ، وتم تخفيف عينات (كدنا) المخففة بالتسلسل 5 مرات إلى 1 نانوغرام من الحمض النووي الجيني البشري.يظهر منحنى الانصهار في الشكل الداخلي.

C. تم تكرار تفاعل RT ، والتخفيف ، والتخفيف التسلسلي لعينة (كدنا) الثانية ، وكانت النتائج متشابهة.

يُظهر P 8 منحنيين قياسيين ، باستخدام نفس طريقة الكشف على عينتين مختلفتين (كدنا) ، والنتيجة هي نفس الكفاءة ، حوالي 100 ٪ ، وقيمة R2 متشابهة أيضًا ، أي درجة الملاءمة بين البيانات التجريبية وخط الانحدار أو البيانات درجة الخطية.

المنحنيان القياسيان متشابهان ، لكنهما ليسا متماثلين تمامًا.إذا كان الغرض هو التحديد الكمي للهدف بدقة ، فيجب ملاحظة أنه من غير المقبول توفير حساب رقم النسخ دون توضيح عدم اليقين

P9 |الارتياب في القياس المرتبط بالتقدير الكمي باستخدام منحنى قياسي.

أ. استخدم البادئات لـ GAPDH (NM_002046) لأداء PCR وظروف منحنى الانصهار.F: ACAGTTGCCATGTAGACC و R: TAACTGTTGAGCACAGG و Bioline Sensifast SYBR mastermix (رقم الكتالوج BIO-98050).

B. مخطط التضخيم ومنحنى الانصهار والمنحنى القياسي المسجل بأداة CFX qPCR من Bio-Rad.

ج- الرسم البياني للمنحنى القياسي وفاصل الثقة 95٪ (CI).

D. رقم النسخة وفاصل الثقة 95٪ لقيم Cq الثلاثة المشتقة من منحنى التخفيف.

يوضح P 9 أنه بالنسبة للاختبار الأمثل ، يكون التباين المتأصل لمنحنى قياسي واحد تقريبًا مرتين (فاصل الثقة 95٪ ، من الحد الأدنى إلى الحد الأقصى) ، وهو ما قد يكون أصغر تباين يمكن توقعه.

المنتجات ذات الصلة:

عدة خلية مباشرة RT qPCR

طقم ذيل الماوس المباشر PCR

عدة PCR الأنسجة الحيوانية المباشر