تم تطوير RT-qPCR من تقنية PCR العادية.يضيف المواد الكيميائية الفلورية (الأصباغ الفلورية أو المجسات الفلورية) إلى نظام تفاعل PCR التقليدي ، ويكتشف عملية التلدين والتمديد PCR في الوقت الفعلي وفقًا لآليات الإنارة المختلفة الخاصة بهم.تُستخدم تغييرات إشارة الفلورسنت في الوسط لحساب مقدار تغيير المنتج في كل دورة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل.حاليًا ، أكثر الطرق شيوعًا هي طريقة الصبغة الفلورية وطريقة التحقيق.

طريقة صبغ الفلورسنت:
بعض الأصباغ الفلورية ، مثل SYBR Green Ⅰ ، و PicoGreen ، و BEBO ، وما إلى ذلك ، لا تصدر ضوءًا من تلقاء نفسها ، ولكنها تنبعث منها الفلورة بعد الارتباط بالأخدود الصغير لـ dsDNA.لذلك ، في بداية تفاعل PCR ، لا يمكن للآلة اكتشاف إشارة الفلورسنت.عندما ينتقل التفاعل إلى تمديد التلدين (طريقة من خطوتين) أو مرحلة التمديد (طريقة من ثلاث خطوات) ، يتم فتح الخيوط المزدوجة في هذا الوقت ، وبوليميراز الحمض النووي الجديد أثناء تخليق الخيوط ، يتم دمج الجزيئات الفلورية في أخدود ثانوي dsDNA وتنبعث منها الفلورة.مع زيادة عدد دورات PCR ، تتحد المزيد والمزيد من الأصباغ مع dsDNA ، كما يتم أيضًا تحسين إشارة الفلورسنت باستمرار.خذ SYBR Green Ⅰ كمثال.
طريقة التحقيق:
مسبار Taqman هو أكثر مسبار التحلل المائي استخدامًا.توجد مجموعة فلورية في نهاية 5 ′ من المسبار ، وعادة ما تكون FAM.المسبار نفسه هو تسلسل مكمل للجين المستهدف.توجد مجموعة تبريد الفلورسنت في نهاية 3 من الفلوروفور.وفقًا لمبدأ نقل طاقة الرنين الفلوري (نقل طاقة الرنين Förster ، FRET) ، عندما تكون مجموعة الفلورسنت المراسل (جزيء الفلورسنت المتبرع) ومجموعة الفلورسنت المبردة (جزيء الفلورسنت المتقبل) عندما يتداخل طيف الإثارة والمسافة قريبة جدًا (7-10 نانومتر) ، يمكن أن تحفز إثارة جزيء المتبرع قبول جزيء المتبرع.لذلك ، في بداية تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، عندما يكون المسبار مجانيًا وسليمًا في النظام ، لن تصدر مجموعة الفلورسنت المراسل أي مضان.عند التلدين ، يلتزم التمهيدي والمسبار بالقالب.أثناء مرحلة التمديد ، يصنع البوليميراز سلاسل جديدة باستمرار.يحتوي بوليميريز الحمض النووي على نشاط نوكلياز خارجي 5′-3.عند الوصول إلى المسبار ، سوف يتحلل بوليميراز الحمض النووي المسبار من القالب ، ويفصل مجموعة الفلورسنت المراسل عن مجموعة الفلورسنت المخمدة ، ويطلق إشارة الفلورسنت.نظرًا لوجود علاقة رأس برأس بين المجس والقالب ، فإن طريقة المسبار تتفوق على طريقة الصبغة من حيث دقة الاختبار وحساسيته.

الشكل 1 مبدأ qRT-PCR

تصميم التمهيدي
مبادئ:

يجب تصميم البادئات في المنطقة المحفوظة من سلسلة الأحماض النووية ولها خصوصية.

من الأفضل استخدام تسلسل cDNA ، كما أن تسلسل mRNA مقبول أيضًا.إذا لم يكن كذلك ، فابحث عن تصميم منطقة الأقراص المضغوطة لتسلسل الحمض النووي.
يبلغ طول المنتج الكمي الفلوري 80-150 نقطة أساس ، والأطول هو 300 نقطة أساس ، ويتراوح طول التمهيدي بشكل عام بين 17-25 قاعدة ، ويجب ألا يكون الفرق بين البادئات الأولية والنهائية كبيرًا جدًا.

يتراوح محتوى G + C بين 40٪ و 60٪ و 45-55٪ هو الأفضل.
تتراوح قيمة TM بين 58-62 درجة.
حاول تجنب ثنائيات البرايمر والثنائيات الذاتية (لا تظهر أكثر من 4 أزواج من القواعد التكميلية المتتالية) هيكل دبوس الشعر ، إذا كان لا مفر منه ، اجعل ΔG <4.5kJ / mol * إذا لم تتمكن من التأكد من إزالة gDNA أثناء النسخ العكسي للتنظيف ، فمن الأفضل تصميم البادئات من intron * 3 لا يمكن تعديل البنية الأولية ، وتجنب A / T ، و G
محدد من الأفضل أن يكون تجانس التسلسل المضخم بشكل غير متجانس أقل من 70٪ أو يحتوي على 8 تجانس أساسي تكميلي.
قاعدة البيانات:
بحث CottonFGD بالكلمات الرئيسية
تصميم التمهيدي:
التصميم التمهيدي IDT-qPCR

صفحة أداة التصميم التمهيدي عبر الإنترنت Fig2 IDT

عرض صفحة نتائج الشكل 3
تصميم الاشعال lncRNA:
lncRNA:نفس خطوات مرنا.
ميرنا:مبدأ طريقة الحلقة الجذعية: نظرًا لأن جميع miRNAs عبارة عن تسلسلات قصيرة تبلغ حوالي 23 نانومتر ، فلا يمكن إجراء الكشف المباشر عن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لذلك يتم استخدام أداة تسلسل الحلقة الجذعية.تسلسل الحلقة الجذعية عبارة عن دنا أحادي السلسلة يبلغ حوالي 50 نانو طنًا ، والذي يمكن أن يشكل بنية دبوس الشعر في حد ذاته.3 'يمكن تصميم النهاية كتسلسل مكمل لجزء ميرنا الجزئي ، ثم يمكن توصيل ميرنا الهدف بتسلسل الحلقة الجذعية أثناء النسخ العكسي ، ويمكن أن يصل الطول الإجمالي إلى 70 نقطة أساس ، وهو ما يتماشى مع طول المنتج المضخم الذي يحدده qPCR.المخلفات التصميم التمهيدي ميرنا.
الكشف الخاص بالتضخيم:
قاعدة بيانات الانفجار على الإنترنت: انفجار CottonFGD عن طريق تشابه التسلسل
انفجار محلي: ارجع إلى استخدام Blast + للقيام بتفجير محلي ، ويمكن لنظام Linux و macos إنشاء قاعدة بيانات محلية مباشرة ، ويمكن أيضًا تنفيذ نظام win10 بعد تثبيت ubuntu bash.إنشاء قاعدة بيانات محلية للانفجار والانفجار المحلي ؛افتح ubuntu bash على win10.
ملاحظة: قطن المرتفعات وقطن جزيرة البحر عبارة عن محاصيل رباعية الصبغيات ، لذلك ستكون نتيجة الانفجار غالبًا تطابقين أو أكثر.في الماضي ، كان من المرجح أن يؤدي استخدام أقراص NAU كقاعدة بيانات لأداء الانفجار إلى العثور على جينين متماثلين مع القليل من الاختلافات في SNP.عادة ، لا يمكن فصل الجينين المتماثلين عن طريق التصميم التمهيدي ، لذلك يتم التعامل معهما على أنهما نفس الشيء.إذا كان هناك indel واضحًا ، فعادة ما يتم تصميم التمهيدي على indel ، ولكن هذا قد يؤدي إلى الهيكل الثانوي للطلاء التمهيدي. تصبح الطاقة الحرة أعلى ، مما يؤدي إلى انخفاض في كفاءة التضخيم ، ولكن هذا أمر لا مفر منه.

الكشف عن الهيكل الثانوي التمهيدي:
خطوات:افتح oligo 7 ← تسلسل قالب الإدخال ← إغلاق النافذة الفرعية ← حفظ ← تحديد موقع التمهيدي على القالب ، اضغط على ctrl + D لتعيين طول التمهيدي ← تحليل الهياكل الثانوية المختلفة ، مثل جسم التقسيم الذاتي ، مغاير ، دبوس الشعر ، عدم التطابق ، إلخ. آخر صورتين في الشكل 4 هي نتائج اختبار البرايمر.نتيجة التمهيدي الأمامي جيدة ، فلا يوجد هيكل واضح للثنائيات ودبابيس الشعر ، ولا توجد قواعد تكميلية مستمرة ، والقيمة المطلقة للطاقة الحرة أقل من 4.5 ، بينما يظهر التمهيدي الخلفي مستمر. القواعد الستة مكملة ، والطاقة الحرة 8.8 ؛بالإضافة إلى ذلك ، يظهر دايمر أكثر خطورة في النهاية 3 ويظهر دايمر من 4 قواعد متتالية.على الرغم من أن الطاقة الحرة ليست عالية ، إلا أن 3-dimer Chl يمكن أن يؤثر بشكل خطير على خصوصية التضخيم وكفاءة التضخيم.بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري التحقق من وجود دبابيس الشعر ، ومقاييس غير متجانسة ، وعدم تطابق.

نتائج الكشف عن الشكل 3 oligo7
كشف كفاءة التضخيم:
تؤثر كفاءة تضخيم تفاعل PCR بشكل خطير على نتائج PCR.أيضًا في qRT-PCR ، تكون كفاءة التضخيم مهمة بشكل خاص للنتائج الكمية.قم بإزالة المواد والآلات والبروتوكولات الأخرى في مخزن التفاعل.تؤثر جودة البادئات أيضًا بشكل كبير على كفاءة التضخيم لـ qRT-PCR.من أجل ضمان دقة النتائج ، يحتاج كل من القياس الكمي النسبي للفلورة والتقدير الكمي المطلق إلى الكشف عن كفاءة التضخيم في الاشعال.من المعروف أن كفاءة تضخيم qRT-PCR الفعالة تتراوح بين 85٪ و 115٪.هناك طريقتان:
1. طريقة المنحنى القياسية:
أ.مزيج (كدنا)
ب.تخفيف متدرج
ج. qPCR
د.معادلة الانحدار الخطي لحساب كفاءة التضخيم
2. LinRegPCR
LinRegPCR هو برنامج لتحليل بيانات RT-PCR في الوقت الحقيقي ، وتسمى أيضًا بيانات PCR الكمية (qPCR) استنادًا إلى SYBR Green أو كيمياء مماثلة.يستخدم البرنامج بيانات مصححة غير أساسية ، ويقوم بتصحيح خط الأساس لكل عينة بشكل منفصل ، ويحدد نافذة خطية ثم يستخدم تحليل الانحدار الخطي لملاءمة خط مستقيم من خلال مجموعة بيانات PCR.من منحدر هذا الخط ، يتم حساب كفاءة PCR لكل عينة فردية.يتم استخدام متوسط ​​كفاءة PCR لكل amplicon وقيمة Ct لكل عينة لحساب تركيز البداية لكل عينة ، معبرًا عنه في وحدات الفلورة التعسفية.يتم إدخال البيانات وإخراجها من خلال جدول بيانات Excel.عينة فقط
الخلط مطلوب ، لا تدرج
الخطوات المطلوبة:(خذ Bole CFX96 كمثال ، وليس آلة مع ABI واضح)
تجربة:إنها تجربة qPCR قياسية.
إخراج بيانات qPCR:يمكن لـ LinRegPCR التعرف على شكلين من ملفات الإخراج: RDML أو نتيجة التضخيم الكمي.في الواقع ، إنها قيمة الكشف في الوقت الفعلي لرقم الدورة وإشارة الفلورة بواسطة الجهاز ، ويتم الحصول على التضخيم من خلال تحليل قيمة تغيير التألق لكفاءة المقطع الخطي.
اختيار البيانات: من الناحية النظرية ، يجب أن تكون قيمة RDML قابلة للاستخدام.تشير التقديرات إلى أن مشكلة جهاز الكمبيوتر الخاص بي هي أن البرنامج لا يمكنه التعرف على RDML ، لذلك لدي قيمة إخراج excel كبيانات أصلية.يوصى بإجراء فحص تقريبي للبيانات أولاً ، مثل فشل إضافة العينات ، إلخ. يمكن حذف النقاط في بيانات الإخراج (بالطبع ، لا يمكنك حذفها ، سيتجاهل LinRegPCR هذه النقاط في المرحلة اللاحقة)

تصدير بيانات Fig5 qPCR

اختيار الشكل 6 من العينات المرشحة

إدخال بيانات:فتح نتائج تضخيم التأهيل. xls ، ← افتح LinRegPCR ← ملف ← اقرأ من Excel ← حدد المعلمات كما هو موضح في الشكل 7 ← موافق ← انقر فوق تحديد خطوط الأساس

الشكل 7 خطوات إدخال بيانات linRegPCR

نتيجة:إذا لم يكن هناك تكرار ، فلا حاجة إلى تجميع.إذا كان هناك تكرار ، فيمكن تحرير التجميع في تجميع العينة ، وإدخال اسم الجين في المعرف ، ثم يتم تجميع نفس الجين تلقائيًا.أخيرًا ، انقر فوق الملف ، ثم قم بتصدير ملف Excel ، واعرض النتائج.سيتم عرض كفاءة التضخيم ونتائج R2 لكل بئر.ثانيًا ، إذا قسمت إلى مجموعات ، فسيتم عرض متوسط ​​كفاءة التضخيم المصحح.تأكد من أن كفاءة التضخيم لكل جهاز تمهيدي بين 85٪ و 115٪.إذا كان كبيرًا جدًا أو صغيرًا جدًا ، فهذا يعني أن كفاءة تضخيم التمهيدي ضعيفة.

الشكل 8 نتيجة وإخراج البيانات

العملية التجريبية:
متطلبات جودة RNA:
نقاء:1.72.0 يشير إلى أنه قد يكون هناك أيزوثيوسيانات متبقية.يجب أن يكون الحمض النووي النظيف A260 / A230 حوالي 2. إذا كان هناك امتصاص قوي عند 230 نانومتر ، فهذا يشير إلى وجود مركبات عضوية مثل أيونات الفينيت.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اكتشافه بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 1.5٪.أشر إلى العلامة ، لأن ssRNA ليس له تمسخ ولوغاريتم الوزن الجزيئي ليس له علاقة خطية ، ولا يمكن التعبير عن الوزن الجزيئي بشكل صحيح.التركيز: نظريالاأقل من 100 نانوغرام / مايكرولتر ، إذا كان التركيز منخفضًا جدًا ، فإن النقاوة تكون منخفضة بشكل عام وليست طويلة

التين 9 RNA هلام

بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت العينة ثمينة وكان تركيز الحمض النووي الريبي مرتفعًا ، يوصى بتقسيمها بعد الاستخراج ، وتخفيف الحمض النووي الريبي إلى تركيز نهائي من 100-300 نانوغرام / ul للنسخ العكسي.فيعملية النسخ العكسي، عندما يتم نسخ mRNA ، يتم استخدام بادئات oligo (dt) التي يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بذيول polyA للنسخ العكسي ، بينما يستخدم lncRNA و circRNA بادئات سداسية عشوائية (عشوائية 6 مير) للنسخ العكسي للحمض النووي الريبي الكلي.أطلقت العديد من الشركات الآن مجموعات خاصة من المخلفات.بالنسبة لطريقة الحلقة الجذعية ، تكون طريقة المخلفات أكثر ملاءمة ، وذات إنتاجية عالية ، وتوفر الكواشف ، ولكن يجب ألا يكون تأثير تمييز miRNAs من نفس العائلة جيدًا مثل طريقة الحلقة الجذعية.تحتوي كل مجموعة نسخ عكسي على متطلبات لتركيز البادئات الخاصة بالجينات (حلقات جذعية).المرجع الداخلي المستخدم لـ miRNA هو U6.في عملية قلب الحلقة الجذعية ، يجب عكس أنبوب U6 بشكل منفصل ، ويجب إضافة البادئات الأمامية والخلفية لـ U6 مباشرة.يمكن لكل من CircRNA و lncRNA استخدام HKGs كمرجع داخلي.فيكشف كدنا ،
إذا لم تكن هناك مشكلة مع الحمض النووي الريبي ، فيجب أن تكون (كدنا) جيدة أيضًا.ومع ذلك ، إذا تم السعي لتحقيق الكمال في التجربة ، فمن الأفضل استخدام جين مرجعي داخلي (الجين المرجعي ، RG) يمكنه تمييز gDNA عن الأقراص المدمجة.بشكل عام ، RG هو جين التدبير المنزلي.، HKG) كما هو موضح في الشكل 10 ؛في ذلك الوقت ، كنت أصنع بروتين تخزين فول الصويا ، واستخدمت الأكتين 7 المحتوي على إنترونات كمرجع داخلي.كان حجم الجزء المضخم من هذا التمهيدي في gDNA 452 نقطة أساس ، وإذا تم استخدام cDNA كقالب ، فقد كان 142 نقطة أساس.ثم وجدت نتائج الاختبار أن جزءًا من cDNA كان ملوثًا بالفعل بواسطة gDNA ، وأثبت أيضًا أنه لا توجد مشكلة في نتيجة النسخ العكسي ، ويمكن استخدامه كقالب لـ PCR.لا جدوى من تشغيل الاغاروز الكهربائي للهلام مباشرة باستخدام (كدنا) ، وهو شريط منتشر ، وهو غير مقنع.

الشكل 10 كشف كدنا

تحديد شروط qPCRبشكل عام لا توجد مشكلة وفقًا لبروتوكول المجموعة ، خاصة في خطوة قيمة tm.إذا لم يتم تصميم بعض البادئات بشكل جيد أثناء تصميم التمهيدي ، مما أدى إلى اختلاف كبير بين قيمة tm ونظرية 60 درجة مئوية ، فمن المستحسن أن cDNA بعد خلط العينات ، قم بتشغيل التدرج PCR باستخدام البادئات ، وحاول تجنب ضبط درجة الحرارة بدون نطاقات كقيمة TM.

تحليل البيانات

طريقة معالجة PCR الكمي التقليدية الفلورية النسبية هي أساسًا وفقًا لـ 2-ΔΔCT.نموذج معالجة البيانات.

منتجات ذات صله:

الوقت الحقيقي PCR سهل^TM - تاكمان

الوقت الحقيقي PCR سهل^TM -SYBR GREEN أنا

RT Easy I (Master Premix لتوليف cDNA الأول)

RT Easy II (Master Premix لتوليف أول حبلا cDNA لـ qPCR)