PCR الكمي الفلوري (المعروف أيضًا باسم TaqMan PCR ، المشار إليه فيما يلي باسم FQ-PCR) هو تقنية كمية جديدة للحمض النووي تم تطويرها بواسطة PE (Perkin Elmer) في الولايات المتحدة في عام 1995. تعتمد هذه التقنية على PCR التقليدي عن طريق إضافة مجسات الفلورسنت المسمى.بالمقارنة مع PCR المرن ، يتمتع FQ-PCR بالعديد من المزايا لتحقيق وظيفته الكمية.تهدف هذه المقالة إلى وصف خصائص ومبادئ وأساليب وتطبيقات التكنولوجيا بإيجاز.

1 الميزات

لا يتمتع FQ-PCR فقط بالحساسية العالية لـ PCR العادي ، ولكن أيضًا بسبب تطبيق مجسات الفلورسنت ، يمكنه الكشف مباشرة عن تغيير إشارة الفلورسنت أثناء تضخيم PCR من خلال نظام التوصيل الكهروضوئي للحصول على نتائج كمية ، والتي تتغلب على العديد من أوجه القصور في PCR التقليدي ، لذلك فهي تتميز أيضًا بالخصوصية العالية لتهجين الحمض النووي والدقة العالية لتقنية التحليل الطيفي.

على سبيل المثال ، يجب ملاحظة منتجات PCR العامة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتلطيخ بروميد الإيثيديوم بالأشعة فوق البنفسجية أو بواسطة الرحلان الكهربي لهلام البولي أكريلاميد وتلطيخ الفضة.هذا لا يتطلب أدوات متعددة فحسب ، بل يتطلب أيضًا وقتًا وجهدًا.تعتبر البقع المستخدمة من بروميد الإيثيديوم ضارة بجسم الإنسان ، وتوفر هذه الإجراءات التجريبية المعقدة فرصًا للتلوث والإيجابيات الكاذبة.ومع ذلك ، يحتاج FQ-PCR فقط إلى فتح الغطاء مرة واحدة أثناء تحميل العينة ، والعملية اللاحقة هي عملية أنبوب مغلق تمامًا ، والتي لا تتطلب معالجة ما بعد PCR ، وتجنب العديد من العيوب في عمليات PCR التقليدية.تستخدم التجربة عمومًا جهاز التدوير الحراري ABI7100 PCR الذي طورته شركة PE.

تتميز الأداة بالخصائص التالية: ① الاستخدام الواسع: يمكن استخدامها لتقدير منتج DNA و RNA PCR ، وأبحاث التعبير الجيني ، واكتشاف مسببات الأمراض ، وتحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل.② مبدأ كمي فريد: باستخدام المجسات ذات العلامات الفلورية ، سوف تتراكم كمية التألق مع دورة PCR بعد إثارة الليزر ، وذلك لتحقيق الغرض من القياس الكمي.③ كفاءة عمل عالية: جهاز تدوير حراري مدمج 9600 PCR ، يتم التحكم في الكمبيوتر من ساعة إلى ساعتين لإكمال التضخيم والتقدير الكمي لـ 96 عينة تلقائيًا ومتزامن.④ لا حاجة للهلام الكهربائي للهلام: لا حاجة لتخفيف العينة ورحلانها الكهربائي ، فقط استخدم مسبارًا خاصًا للكشف مباشرة في أنبوب التفاعل.⑤ لا تلوث في خط الأنابيب: تم ​​اعتماد أنبوب التفاعل الفريد المغلق بالكامل ونظام التوصيل الكهروضوئي ، لذلك لا داعي للقلق بشأن التلوث.النتائج قابلة للتكرار: النطاق الديناميكي الكمي يصل إلى خمسة أوامر من حيث الحجم.لذلك ، منذ أن تم تطوير هذه التكنولوجيا بنجاح ، فقد تم تقديرها من قبل العديد من الباحثين العلميين وتم تطبيقها في العديد من المجالات.

2 المبادئ والأساليب

مبدأ عمل FQ-PCR هو استخدام 5 ′ → 3 نشاط نوكلياز خارجي من إنزيم Taq لإضافة مسبار ذي علامة فلورية إلى نظام تفاعل PCR.يمكن للمسبار التهجين على وجه التحديد مع قالب الحمض النووي الموجود في تسلسل التمهيدي.يتم تمييز الطرف الخامس من المسبار بجين الانبعاث الفلوري FAM (6-carboxyfluorescein ، ذروة انبعاث الفلورة عند 518 نانومتر) ، ويتم تمييز النهاية الثالثة بمجموعة إخماد الفلورة TAMRA (6-carboxytramethylrhodamine ، انبعاث مضان ، ذروة الانبعاث عند 582 نانومتر) يتم تمديدها أثناء تضخيم PCR.عندما يظل المسبار سليمًا ، تقوم مجموعة التبريد بقمع انبعاث الفلورة لمجموعة الانبعاث.بمجرد فصل مجموعة الانبعاث عن مجموعة التبريد ، يتم رفع التثبيط ، وتزداد الكثافة الضوئية عند 518 نانومتر ويتم اكتشافها بواسطة نظام الكشف عن التألق. في مرحلة إعادة التشبع ، يتهجين المسبار مع قالب الحمض النووي ، ويتحرك إنزيم Taq في مرحلة التمديد على طول قالب الحمض النووي مع امتداد التمهيدي.عندما يتم قطع المسبار ، يتم تحرير تأثير التبريد وإطلاق إشارة الفلورسنت.في كل مرة يتم فيها نسخ القالب ، يتم قطع المسبار ، مصحوبًا بإطلاق إشارة الفلورسنت.نظرًا لوجود علاقة رأس برأس بين عدد مركبات الفلور التي تم إطلاقها وعدد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد حجم القالب بدقة.تستخدم الأداة التجريبية بشكل عام جهاز التدوير الحراري ABI7100 PCR الذي طورته شركة PE ، ويمكن أيضًا استخدام أجهزة تدوير حرارية أخرى.إذا تم استخدام نظام تفاعل نوع ABI7700 للتجربة ، بعد اكتمال التفاعل ، يمكن إعطاء النتائج الكمية مباشرة من خلال تحليل الكمبيوتر.إذا كنت تستخدم أجهزة تدوير حرارية أخرى ، فأنت بحاجة إلى استخدام كاشف مضان لقياس إشارة التألق في أنبوب التفاعل في نفس الوقت لحساب RQ + ، RQ- ، △ RQ.يمثل RQ + نسبة شدة التألق لمجموعة انبعاث الفلورسنت لأنبوب العينة إلى شدة التألق لمجموعة التبريد ، RQ- يمثل نسبة الاثنين في الأنبوب الفارغ ، △ RQ (△ RQ = RQ + -RQ-) يمثل مقدار تغيير إشارة التألق أثناء PCR بعد معالجة البيانات ، يمكن الحصول على النتائج الكمية.بسبب إدخال مجسات الفلورسنت ، تم تحسين خصوصية التجربة بشكل كبير.يجب أن يفي تصميم المسبار بشكل عام بالشروط التالية: يجب أن يكون طول المسبار حوالي 20-40 قاعدة لضمان خصوصية الربط.يتراوح محتوى قواعد GC بين 40٪ و 60٪ لتجنب ازدواجية متواليات النوكليوتيدات المفردة.③ تجنب التهجين أو التداخل مع البادئات.④ ثبات الربط بين المسبار والقالب أكبر من ثبات الربط بين التمهيدي والقالب ، لذلك يجب أن تكون قيمة Tm للمسبار أعلى بـ 5 درجات مئوية على الأقل من قيمة Tm الخاصة بالبادئة.بالإضافة إلى ذلك ، فإن تركيز المجس ، والتماثل بين المسبار وتسلسل القالب ، والمسافة بين المسبار والبرايمر كلها لها تأثير على نتائج التجربة.

منتجات ذات صله:

الصين Lnc-RT Heroᵀᴹ I (مع gDNase) (Super Premix لتوليف cDNA أول حبلا من lncRNA) المُصنع والمورد |Foregene (forivd.com)

الصين في الوقت الحقيقي PCR Easyᵀᴹ-Taqman الصانع والمورد |Foregene (forivd.com)