تتضمن تجربة RT-qPCR استخراج الحمض النووي الريبي وتقييم الجودة والنسخ العكسي وخطوات qPCR الثلاث ، وكل خطوة بها الكثير من الاحتياطات ، وسوف نقدم بالتفصيل أدناه.

Ⅰ.تقييم جودة الحمض النووي الريبي

في تجربة RT-qPCR ، بعد الانتهاء من استخراج الحمض النووي الريبي ، يجب تقييم جودة الحمض النووي الريبي ، ولا يمكن إجراء تجربة المتابعة إلا بعد أن يتم تأهيلها.تشمل طرق التقييم مقياس الطيف الضوئي ، الرحلان الكهربائي للهلام Agilent ، تحليل Agilent 2100 ، من بينها مقياس الطيف الضوئي الأكثر شيوعًا واكتشاف طريقة الرحلان الكهربائي بهلام الاغاروز.وتجدر الإشارة إلى أنه يجب استخدام هاتين الطريقتين معًا لاستكمال اكتشاف وتحليل تركيز الحمض النووي الريبي ونقاوته وسلامته ، وذلك لضمان جودة الحمض النووي الريبي.

مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ذات الصلة: 

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للخلايا

يمكن الحصول على الحمض النووي الريبي الكلي عالي النقاء وعالي الجودة من الخلايا المستزرعة المختلفة في 11 دقيقة.

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للحيوان

استخراج الحمض النووي الريبي الكلي عالي النقاء وعالي الجودة من الأنسجة الحيوانية المختلفة بسرعة وكفاءة.

مقياس الطيف الضوئي:

يستخدم مقياس الطيف الضوئي بشكل أساسي لتحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي ، ولكنه لا يستطيع الكشف عن سلامة الحمض النووي الريبي (RNA) والمخلفات الجينومية.من بينها ، تعد A260 / 280 و A260 / 230 معلمات مهمة للكشف عن نقاء الحمض النووي الريبي ، ويمكن اكتشاف نقاء الحمض النووي الريبي وفقًا لتقلب قيمها:

1. 1.9 2.1 ، مما يشير إلى احتمال التحلل الجزئي للحمض النووي الريبي ، والذي يمكن تأكيده بشكل أكبر بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام.

2. 2.0

الاغاروز الكهربائي للهلام:

يمكن لفحص الرحلان الكهربائي للهلام من Agarose تحليل سلامة الحمض النووي الريبي ، ومخلفات الجينوم والبروتين ، ولكن لا يمكنه تحديد تركيز الحمض النووي الريبي بدقة أو اكتشاف بقايا الكواشف العضوية.خذ قوالب الحمض النووي الريبي حقيقية النواة على سبيل المثال:

1. تعرض الحمض النووي الريبي إلى الاغاروز الكهربائي للهلام.إذا كان هناك ثلاثة نطاقات مفردة فقط من 28sRNA و 18sRNA و 5.8sRNA على خريطة الهلام ، فهذا يشير إلى أن الحمض النووي الريبي المستخرج سليم.إذا كانت هناك ظاهرة جر ، فإنها تشير إلى تدهور جزئي للحمض النووي الريبي.

2. إذا كان هناك شريط ساطع واحد بين ثقب الغراء وشريط 28sRNA ، فقد يكون هناك بقايا الحمض النووي الجينومي.

3. إذا ظهرت شرائط في فتحة الغراء ، فهذا يشير إلى أنه قد تكون هناك بقايا من البروتين ومواد جزيئية أخرى.

Ⅱ. النسخ العكسي

بعد اكتمال استخراج الحمض النووي الريبي ، يجب عكسه إلى (كدنا) لإجراء تجارب لاحقة ، وبالتالي فإن خطوة الانعكاس ضرورية.سيتم تقديم النسخ العكسي من اختيار النسخ العكسي والتمهيدي:

اختيار النسخ العكسي:

تتضمن النسخ العكسية النموذجية AMV RTase و MMLV RTase.يتميز RNase H لـ AMV RTase بنشاط قوي ، وطول تخليقي قصير ، وكمية تخليق منخفضة واستقرار حراري جيد (42 ~ 55 ℃).نشاط RNase H لـ MMLV RTase ضعيف ، وطول التركيب طويل ، وكمية التوليف عالية ، والاستقرار الحراري ضعيف (37 ~ 42 ℃).

نظرًا لأن إنزيم RNase H له وظيفة تحطيم قالب RNA ، يجب اختيار MMLV مع نشاط RNase H ضعيف بشكل تفضيلي أثناء النسخ العكسي ، وبعد الهندسة الوراثية اللاحقة ، وصل الاستقرار الحراري لـ MMLV إلى قفزة نوعية.مع الأخذ في المقدمةForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV للنسخ العكسي) على سبيل المثال ، إنه نسخة عكسية جديدة يتم التعبير عنها في بكتيريا E. coli باستخدام تقنية إعادة التركيب الجيني.وهو عبارة عن بوليميراز DNA مؤتلف يقوم بتركيب خيط DNA مكمل من الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي: هجين الحمض النووي.لا يحتوي على نشاط RNase H ، واستقرار قوي ، وتقارب RNA قوي ، وحساسية عالية للكشف.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV للنسخ العكسي)

اختيار التمهيدي:

تنقسم البادئات RT عمومًا إلى ثلاث فئات: oligo dT ، والبادئات العشوائية ، والبادئات الخاصة بالجينات.حدد مواد أولية مناسبة للاستخدام وفقًا لمتطلبات تجريبية مختلفة.

1. إذا كان القالب من أصل حقيقي النواة وتم استخدام cDNA المتأخر لتضخيم PCR الروتيني ، يوصى باستخدام Oligo (dT) ؛إذا تم استخدام التجربة اللاحقة فقط لـ qPCR ، يوصى بخلط Oligo (dT) مع الاشعال العشوائي لتحسين كفاءة النسخ العكسي.

2. إذا كان القالب من بدائيات النوى ، فيجب اختيار مواد أولية عشوائية أو بادئات محددة للجينات للنسخ العكسي.

Ⅲ.qPCR

يتم وضع القياس الكمي للضوء بشكل أساسي من خلال اختيار الأساليب الكمية ، ومبادئ التصميم التمهيدي ، واختيار ROX ، وتكوين نظام التفاعل ، وإعداد ظروف التفاعل ، إلخ.

اختيار الأساليب الكمية:

تنقسم الأساليب الكمية إلى طرق كمية نسبية وأساليب كمية مطلقة.يمكن استخدام التقدير الكمي النسبي لاكتشاف تأثير بعض طرق العلاج على التعبير الجيني ، واكتشاف اختلاف التعبير الجيني في أوقات مختلفة ومقارنة اختلاف التعبير الجيني في الأنسجة المختلفة.يمكن أن يكشف التقدير الكمي المطلق عن كمية الحمض النووي في الفيروس وما إلى ذلك.عند إجراء التجارب ، يجب أن نختار الأساليب الكمية المناسبة وفقًا لتجاربنا الخاصة.

مبادئ التصميم التمهيدي:

يرتبط تصميم التمهيدي لـ qPCR ارتباطًا مباشرًا بكفاءة التضخيم وخصوصية المنتج.لذلك ، فإن التصميم الصحيح للبادئات الجيدة هو الخطوة الأولى لنجاح qPCR.في تصميم البرايمر ، يجب الانتباه إلى المبادئ التالية عند تلبية مبدأ التصميم التمهيدي التقليدي:

1. يتم التحكم في طول الجزء المستهدف بين 100 و 300 نقطة أساس ؛

2. تصميم عبر exon لتجنب تأثير الحمض النووي الجيني ؛

3. تحتاج البادئات المصممة إلى اختبار لكفاءة التضخيم ، وفقط عندما تصل كفاءة التضخيم إلى المعيار (90-110٪) يمكن استخدامها في التجارب الكمية ؛

4. عادة ما يتم تحسين تركيز التمهيدي بين 0.1uM و 1.0uM.

اختيارROX:

في عملية التفاعل الكمي ، يمكن لـ ROX ضبط اختلاف المسار البصري أو خطأ الماصات أو اختلاف الحجم الناجم عن التبخر والتكثيف بشكل موحد ، مما يؤدي إلى تحسين إمكانية تكرار النتائج.ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن اختيار ROX مرتبط بالأداة.إذا كانت أداة qPCR لها وظيفة التصحيح التلقائي للفرق بين الثقوب ، فلن تحتاج إلى إضافة ROX ؛وإلا فإنه يحتاج إلى إضافة تصحيح ROX.يجب أن يكون الشركاء الصغار في شراء الكواشف وفقًا للأداة المستخدمة لاختيار ROX الصحيح ، وتجنب الأخطاء اللاحقة.

تحضير نظام التفاعل:

يفضل استخدام أحجام تفاعل 20ul و 50ul.يجب الانتباه إلى الأمور التالية عند صياغة النظام:

1. يجب تحضير نظام التفاعل عن طريق التهوية في طاولة العمل فائقة النظافة ، ddH الجديد₂يستخدم O لكل تجربة ؛

2. تحتاج كل تجربة إلى إعداد NTC للتحقق مما إذا كان هناك تلوث في النظام ، وكل زوج من البادئات يحتاج إلى القيام بـ NTC عند إعداد النظام ؛

3. لاكتشاف ما إذا كانت هناك بقايا gDNA في قالب الحمض النووي الريبي ، يمكن تحضير العلاج ببدائل النيكوتين لكل عينة للكشف عنها ؛

4. عند تحضير النظام ، يوصى بعمل 3 مكررات تقنية على الأقل لعينة واحدة ؛

5. عندما يكون القالب (كدنا) ، فمن المستحسن تخفيف 5-10 مرات لتقليل تأثير تثبيط نظام النسخ العكسي على تجربة qPCR.من الأفضل استكشاف كمية القالب بالتدرج ، بحيث تقع قيمة CT بين 20-30 ؛

6. تحديد العدد المطلوب من التفاعلات ، وزيادة بنسبة 5-10٪ على أساس عدد التفاعلات ، وحساب رقم تكوين الحجم ؛

7 ، تم إعداد النظام باستخدام مبدأ الخلط المسبق ، والخلط بعد الطرد المركزي والتأكد من عدم وجود فقاعات ؛

8 ، بقدر الإمكان لاختيار المواد الاستهلاكية الداعمة.

مجموعة RT-qPCR ذات الصلة