لا يتم استخراج الحمض النووي الريبي أو أن إنتاجية الحمض النووي الريبي منخفضة

غالبًا ما توجد مجموعة متنوعة من العوامل التي تؤثر على كفاءة الاسترداد ، مثل: محتوى عينة الأنسجة من الحمض النووي الريبي ، وطريقة التشغيل ، وحجم الشطف ، وما إلى ذلك.

1. تم إجراء حمام الجليد أو الطرد المركزي المبرد (4 درجات مئوية) أثناء العملية.

توصية: تعمل في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) طوال العملية برمتها ، لا تستخدم حمام ثلجي وأجهزة الطرد المركزي في درجات حرارة منخفضة.

2. حفظ العينة بشكل غير لائق أو وقت تخزينها المفرط.

توصية: تخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو تجميدها في النيتروجين السائل وتجنب الاستخدام المتكرر للتجميد والذوبان ؛حاول استخدام الأنسجة الطازجة أو الخلايا المستنبتة لاستخراج الحمض النووي الريبي.

3. تحلل العينة غير الكافي.

توصية: عند تجانس الأنسجة ، تأكد من أن الأنسجة متجانسة بدرجة كافية وأن خلايا الأنسجة مقسمة بشكل كافٍ لشرح إطلاق الحمض النووي الريبي.

4. لم يتم إضافة eluent بشكل صحيح.

توصية: تأكد من أن ddH الخالي من RNase₂يضاف O بالتنقيط إلى منتصف غشاء عمود التنقية.

5. لم يتم إضافة الحجم الصحيح من الإيثانول المطلق إلى Buffer RL2 أو Buffer RW2.

توصية: اتبع التعليمات ، أضف الحجم الصحيح من الإيثانول المطلق إلى Buffer RL2 و Buffer RW2 واخلط جيدًا قبل استخدام المجموعة.

6. جرعة عينة الأنسجة ليست مناسبة.

التوصية: استخدم 10-20 مجم من الأنسجة أو (1-5) × 10⁶خلايا لكل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RL1 ، حيث يمكن أن يؤدي الاستخدام المفرط للأنسجة إلى تقليل استخراج الحمض النووي الريبي.

7. حجم شطف غير لائق أو شطف غير كامل.

التوصية: حجم الشطف لعمود التنقية هو 50-200 ميكرولتر ؛إذا لم يكن تأثير الشطف مرضيًا ، يوصى بتمديد وقت وضع درجة حرارة الغرفة بعد إضافة RNase-Free ddH₂O ، على سبيل المثال لمدة 5-10 دقائق.

8- يحتوي عمود التنقية على بقايا إيثانول بعد غسل العازلة RW2.

توصية: إذا كان هناك بقايا من الإيثانول بعد غسل Buffer RW2 ، فإن الطرد المركزي للأنبوب الفارغ لمدة دقيقة واحدة ، ويمكن زيادة وقت عملية الطرد المركزي للأنبوب الفارغ إلى دقيقتين ، أو يمكن وضع عمود التنقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لإزالة الإيثانول المتبقي بشكل مناسب.

تنقية الحمض النووي الريبي يتحلل

ترتبط جودة الحمض النووي الريبي المنقى بعوامل مثل الحفاظ على العينة ، وتلوث الحمض النووي الريبي ، والتلاعب ، إلخ.

1. لا يتم الاحتفاظ بعينات الأنسجة في الوقت المناسب.

توصية: إذا لم يتم استخدام عينات الأنسجة أو الخلايا في الوقت المناسب بعد جمعها ، قم بالحفظ بالتبريد على الفور عند -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل.لاستخراج الحمض النووي الريبي ، استخدم عينة من الأنسجة أو الخلايا المأخوذة حديثًا كلما أمكن ذلك.

2. ذوبان الجليد المتكرر لعينات الأنسجة.

توصية: عند تخزين عينات الأنسجة ، من الأفضل تقطيعها إلى قطع صغيرة لحفظها ، وإزالة إحدى القطع عند استخدامها لتجنب الذوبان المتكرر للعينة وتلف الحمض النووي الريبي.

3. يتم إدخال RNase أو عدم ارتداء القفازات والأقنعة التي تستخدم لمرة واحدة وما إلى ذلك أثناء العملية.

توصية: من الأفضل إجراء تجارب استخراج الحمض النووي الريبي في غرف منفصلة لمعالجة الحمض النووي الريبي ويتم مسح الجدول قبل التجربة.

قم بارتداء القفازات والأقنعة التي تستخدم لمرة واحدة أثناء التجربة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي الناجم عن إدخال RNase.

4. تلوث الكواشف بـ RNase أثناء الاستخدام.

توصية: استبدل بمجموعة جديدة لعزل الحمض النووي الريبي الكلي للحيوان للتجارب ذات الصلة.

5. أنابيب الطرد المركزي ، الرؤوس ، إلخ المستخدمة في معالجة RNA ملوثة بـ RNase.

توصية: تأكد من أن أنابيب أجهزة الطرد المركزي ، والنصائح ، والماصات ، وما إلى ذلك المستخدمة في استخراج الحمض النووي الريبي ، كلها خالية من RNase.

يؤثر الحمض النووي الريبي المنقى الذي تم الحصول عليه على تجارب المصب

RNA المنقى بواسطة عمود التنقية ، إذا كانت أيونات الملح ، محتوى البروتين كبير جدًا سيؤثر على تجربة المصب ، مثل: النسخ العكسي ، Northern Blot et al.

1. يحتوي الحمض النووي الريبي المستخلص على بقايا أيونات الملح.

توصية: تأكد من إضافة الحجم الصحيح من الإيثانول إلى Buffer RW2 وإجراء عمليتي غسيل لعمود التنقية بسرعة الطرد المركزي المشار إليها للتشغيل ؛إذا كان هناك أي بقايا أيون ملح ، اترك عمود التنقية للمخزن المؤقت RW2 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإجراء الطرد المركزي لتعظيم إزالة تلوث الملح.

2. بقايا الإيثانول في الحمض النووي الريبي المصفى.

توصية: تأكد من أنه بعد غسل المخزن المؤقت RW2 ، قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنبوب الفارغ بسرعة الطرد المركزي المحددة للتشغيل ، وقم بزيادة وقت عملية الطرد المركزي للأنبوب الفارغ إلى دقيقتين إذا كان لا يزال هناك بقايا من الإيثانول ، أو اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 أمتار