تعقيم أطراف الماصة وأنابيب EP ، إلخ.

1. قم بإعداد 0.1٪ (واحد بالألف) DEPC (مادة شديدة السمية) بالماء منزوع الأيونات ، واستخدمه بعناية في غطاء دخان ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية بعيدًا عن الضوء ؛

ماء DEPC هو ماء نقي معالج بـ DEPC ومعقم بواسطة درجة حرارة عالية وضغط مرتفع.تم اختباره ليكون خاليًا من RNase و DNase والبروتيناز.

2. ضع طرف الماصة وأنبوب EP في 0.1٪ DEPC ، وتأكد من أن طرف الماصة وأنبوب EP مملوءان بـ 0.1٪ DEP.

3. حماية من الضوء ، دعنا نقف ، بين عشية وضحاها (12-24 ساعة)

4. لا يحتاج الصندوق الذي يحتوي على الطرف وأنبوب EP إلى نقعه في DEPC.بعد إزالة ماء DEPC تقريبًا في الطرف أو أنبوب EP ، قم بتعبئته ولفه.

5. 121 درجة مئوية ، 30 دقيقة

6. 180 درجة مئوية ، جاف لعدة ساعات (3 ساعات على الأقل)

ملاحظة: أ.ارتدِ قفازات وأقنعة من اللاتكس عند التعامل مع DEPC!ب ، أو بدون تعقيم DEPC ، الأوتوكلاف 130 ℃ ، 90 دقيقة (العديد من المختبرات تعقيم درجة حرارة عالية مرتين)

اعتبارات استخراج الحمض النووي الريبي

ظاهرتان رئيسيتان لفشل عزل الحمض النووي الريبي

تدهور الحمض النووي الريبي وبقايا الشوائب في الأنسجة ،فيما يتعلق بالتحلل ، دعنا أولاً نلقي نظرة على سبب عدم تحلل الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا المستنبتة بسهولة.تحتوي جميع كواشف استخراج الحمض النووي الريبي الموجودة على مكونات تمنع RNase بسرعة.أضف المحللة إلى الخلايا المستنبتة ، واخلطها ببساطة ، يمكن خلط جميع الخلايا تمامًا مع المحللة ، ويتم تفكيك الخلايا تمامًا.بعد تحلل الخلايا ، تمنع المكونات النشطة في المحللة على الفور RNase داخل الخلايا ، لذلك يظل الحمض النووي الريبي سليما.وهذا يعني أنه نظرًا لأن الخلايا المستنبتة يتم الاتصال بها بسهولة وبشكل كامل مع المحللة ، فإن الحمض النووي الريبي الخاص بها لا يتحلل بسهولة ؛من ناحية أخرى ، فإن الحمض النووي الريبي في الأنسجة يتحلل بسهولة لأن الخلايا الموجودة في الأنسجة ليس من السهل الاتصال بها بسرعة.بسبب الاتصال الكافي.لذا،بافتراض وجود طريقة لتحويل الأنسجة إلى خلية واحدة مع تثبيط نشاط الحمض النووي الريبي ، يمكن حل مشكلة التدهور تمامًا.

يعتبر طحن النيتروجين السائل أكثر الطرق فعالية.ومع ذلك ، فإن طريقة طحن النيتروجين السائل مزعجة للغاية ، خاصة عندما يكون عدد العينات كبيرًا.أدى هذا إلى ظهور أفضل شيء تالي: المجانس.الالخالطلا تأخذ الطريقة في الاعتبار السؤال عن كيفية تثبيط نشاط RNase قبل ملامسة الخلايا مع المحللة ، ولكنها تدعو بدلاً من ذلك إلى أن يكون معدل تمزق الأنسجة أسرع من معدل تحلل RNase داخل الخلايا.

تأثير الخالط الكهربائي أفضل ،وتأثير الخالط الزجاجي ضعيف ، ولكن بشكل عام ، لا يمكن لطريقة المجانسة أن تمنع ظاهرة التدهور.لذلك ، في حالة تدهور الاستخراج ، يجب استخدام الخالط الكهربائي الأصلي للطحن بالنيتروجين السائل ؛يجب تغيير الخالط الزجاجي الأصلي إلى خالط كهربائي أو طحنه مباشرة بالنيتروجين السائل.المشكلة ممكنة بنسبة 100٪ تقريبًا.الحصول على حل.

مشكلة بقايا الشوائب التي تؤثر على التجارب اللاحقة لها أسباب أكثر تنوعًا من التدهور ، والحلول مختلفة بالمقابل.ختاماً،إذا كان هناك تدهور أو شوائب متبقية في الأنسجة ، فيجب تحسين طريقة الاستخراج / الكاشف للمواد التجريبية المحددة.ليس عليك استخدام عيناتك الثمينة للتحسين: يمكنك شراء بعض الحيوانات الصغيرة مثل الأسماك / الدجاج من السوق ، وأخذ الجزء المقابل من المادة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، والجزء الآخر لاستخراج البروتين - طحن مع مستخلص الفم والمعدة والأمعاء.

يتم استخدام الحمض النووي الريبي المستهدف من الحمض النووي الريبي المستخرج لتجارب متابعة مختلفة ، ومتطلبات الجودة الخاصة به مختلفة

يتطلب بناء مكتبة (كدنا) سلامة الحمض النووي الريبي بدون بقايا مثبطات تفاعل الإنزيم ؛يتطلب الشمال سلامة أعلى من الحمض النووي الريبي ومتطلبات أقل لبقايا مثبطات تفاعل الإنزيم ؛لا يتطلب RT-PCR سلامة عالية جدًا من RNA ،لكنه يثبط تفاعلات الإنزيم.متطلبات المخلفات صارمة.المدخلات تحدد المخرجات.في كل مرة يكون الهدف هو الحصول على أعلى درجة نقاء من الحمض النووي الريبي ، فإنه سيكلف الناس والمال.

جمع / تخزين العينات

العوامل التي تؤثر على التدهور بعد أن تغادر العينة الجسم الحي / أو بيئة النمو الأصلية ، ستبدأ الإنزيمات الداخلية في العينة في تدهور الحمض النووي الريبي ،ويرتبط معدل التحلل بمحتوى الإنزيمات الداخلية ودرجة الحرارة.تقليديا ، هناك طريقتان فقط لتثبيط نشاط الإنزيم الداخلي تمامًا: إضافة المحللة على الفور والتجانس بشكل شامل وسريع ؛تقطع إلى قطع صغيرة وتجمد على الفور في النيتروجين السائل.كلا النهجين يتطلبان عملية سريعة.هذا الأخير مناسب لجميع العينات ، بينما الأول مناسب فقط للأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الخلايا والإنزيمات الداخلية وأسهل في التجانس.على وجه التحديد ، من الأفضل تجميد الأنسجة النباتية ، والكبد ، والغدة الصعترية ، والبنكرياس ، والطحال ، والدماغ ، والدهون ، وأنسجة العضلات ، وما إلى ذلك بالنيتروجين السائل قبل المتابعة.

تجزئة العينات وتجانسها

العوامل المؤثرة في التدهور وتجزئة المحصول هومن أجل التجانس الشامل، وهو للإفراج الكامل والكامل عن الحمض النووي الريبي.يمكن تجانس الخلايا مباشرة دون أن تنكسر.لا يمكن تجانس الأنسجة إلا بعد كسرها.يجب تكسير الخميرة والبكتيريا باستخدام الإنزيمات المقابلة قبل تجانسها.يمكن سحق الأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الإنزيم الداخلي وتجانسها وتجانسها في وقت واحد في المحللة بواسطة المجانسة ؛الأنسجة النباتية ، والكبد ، والغدة الصعترية ، والبنكرياس ، والطحال ، والدماغ ، والدهون ، وأنسجة العضلات وعينات أخرى ، إما أنها غنية بالأنزيمات الداخلية أو لا يمكن تجانسها بسهولة ،لذلك يجب إجراء تمزق الأنسجة والتجانس بشكل منفصل.الطريقة الأكثر موثوقية والأكثر إنتاجية للتجزئة هي الطحن بالنيتروجين السائل ، والطريقة الأكثر موثوقية للتجانس هي استخدام الخالط الكهربائي.ملاحظة خاصة حول الطحن بالنيتروجين السائل: يجب عدم إذابة العينة أثناء عملية الطحن بأكملها ، حيث من المرجح أن تعمل الإنزيمات الداخلية عند التجميد.

اختيار المحللة

التأثير على راحة العملية وعوامل الشوائب الداخلية المتبقية يمكن أن تمنع حلول التحلل الشائعة الاستخدام تقريبًا نشاط RNase.لذلك ، فإن النقطة الأساسية في اختيار محلول التحلل هي النظر في تركيبة مع طريقة التنقية.هناك استثناء واحد:يوصى باستخدام عينات تحتوي على نسبة عالية من الإنزيمات الذاتية لاستخدام محلول يحتوي على الفينول لزيادة القدرة على تعطيل الإنزيمات الذاتية.

اختيار طريقة التنقية

العوامل التي تؤثر على الشوائب الداخلية المتبقية ، وسرعة الاستخراج بالنسبة للعينات النظيفة مثل الخلايا ، يمكن الحصول على نتائج مرضية بأي طريقة تنقية في متناول اليد تقريبًا.ولكن بالنسبة للعديد من العينات الأخرى ، خاصة تلك التي تحتوي على مستويات عالية من الشوائب مثل النباتات والكبد والبكتيريا وما إلى ذلك ، فإن اختيار طريقة تنقية مناسبة أمر بالغ الأهمية.تتميز طريقة تنقية العمود بالطرد المركزي بسرعة استخراج سريعة ويمكنها إزالة الشوائب التي تؤثر على التفاعل الإنزيمي اللاحق للحمض النووي الريبي بشكل فعال ، ولكنها مكلفة (يمكن أن تقدم Foregene مجموعات فعالة من حيث التكلفة ، انقر على مزيد من التفاصيلهنا) ؛باستخدام طرق تنقية اقتصادية وكلاسيكية ، مثل ترسيب LiCl ، يمكن أيضًا الحصول على نتائج مرضية ، لكن وقت التشغيل طويل..

"ثلاثة تخصصات وثمانية اهتمامات" لاستخراج الحمض النووي الريبي

الانضباط 1:وضع حد لتلوث الإنزيمات الخارجية.

ملاحظة 1:قم بارتداء الأقنعة والقفازات بدقة.

ملاحظة 2:يجب التخلص تمامًا من أنابيب أجهزة الطرد المركزي ، ورؤوس الأطراف ، وقضبان الماصة ، وخزانات الرحلان الكهربائي ، والمقاعد التجريبية المشاركة في التجربة.

ملاحظة 3:يجب أن تكون الكواشف / المحاليل المشاركة في التجربة ، وخاصة الماء ، خالية من RNase.

الانضباط 2:منع نشاط الإنزيمات الداخلية

ملاحظة 4:اختر طريقة التجانس المناسبة.

ملاحظة 5:اختر محلل مناسب.

ملاحظة 6:التحكم في كمية بداية العينة.

الانضباط 3:وضح الغرض من الاستخراج

ملاحظة 7:مع اقتراب أي نظام محلل من الحد الأقصى لمقدار بدء العينة ، ينخفض ​​معدل نجاح الاستخراج بشكل حاد.

ملاحظة 8:المعيار الاقتصادي الوحيد لاستخراج الحمض النووي الريبي الناجح هو النجاح في التجارب اللاحقة ، وليس العائد.

أهم 10 مصادر لتلوث RNase

1. الأصابع هي المصدر الأول للإنزيمات الخارجية ، لذلك يجب ارتداء القفازات واستبدالها بشكل متكرر.بالإضافة إلى ذلك ، يجب ارتداء الأقنعة أيضًا ، لأن التنفس هو أيضًا مصدر مهم للإنزيمات.هناك فائدة إضافية لارتداء قناع القفاز وهي حماية المجرب.

2. أطراف الماصات وأنابيب الطرد المركزي والماصات - لا يمكن تعطيل RNase عن طريق التعقيم وحده ، لذلك يجب معالجة أطراف الماصة وأنابيب الطرد المركزي بـ DEPC ، حتى لو تم تمييزها على أنها معالجة DEPC.من الأفضل استخدام ماصة ذات أغراض خاصة ، امسحها بقطعة قطن كحول بنسبة 75٪ قبل الاستخدام ، وخاصة القضيب ؛بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من عدم استخدام مزيل الرأس.

3. يجب أن يكون الماء / المخزن المؤقت خاليًا من تلوث RNase.

4. يجب تنظيف طاولة الاختبار على الأقل باستخدام 75٪ من كرات القطن الكحولية.

5. RNase الذاتية تحتوي جميع الأنسجة على إنزيمات داخلية ، لذا فإن التجميد السريع للأنسجة بالنيتروجين السائل هو أفضل طريقة لتقليل التدهور.إن طريقة تخزين / طحن النيتروجين السائل غير مريحة بالفعل ، ولكنها الطريقة الوحيدة للأنسجة التي تحتوي على مستويات عالية من الإنزيمات الداخلية.

6. عينات الحمض النووي الريبي قد تحتوي منتجات استخراج الحمض النووي الريبي على آثار لتلوث الحمض النووي الريبي.

7. استخراج البلازميد استخلاص البلازميد غالبًا ما يستخدم Rnase لتحطيم الحمض النووي الريبي ، ويجب هضم Rnase المتبقي باستخدام بروتين K واستخراجه بواسطة PCI.

8. تخزين RNA حتى لو تم تخزينه في درجة حرارة منخفضة ، فإن كميات ضئيلة من RNase سوف تسبب تدهور RNA.أفضل حل للحفاظ على المدى الطويل من الحمض النووي الريبي هو تعليق الملح / الكحول ، لأن الكحول يثبط كل النشاط الأنزيمي في درجات حرارة منخفضة.

9. عندما تحتوي الكاتيونات (Ca ، Mg) على هذه الأيونات ، فإن التسخين عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق سيؤدي إلى تشقق الحمض النووي الريبي ، لذلك إذا احتاج الحمض النووي الريبي إلى التسخين ، فيجب أن يحتوي محلول الحفظ على عامل مخلب (1 ملي مولار سيترات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 6.4).

10. قد تكون الإنزيمات المستخدمة في التجارب اللاحقة ملوثة بـ RNase.

10 نصائح لاستخراج الحمض النووي الريبي

1: منع نشاط RNase بسرعة.يتم تجميد العينات بسرعة بعد جمعها ، ويتم تعطيل RNase عن طريق التشغيل السريع أثناء التحلل.

2: اختر طريقة استخراج مناسبة للأنسجة التي تحتوي على نسبة عالية من الريبوزيم ، والأفضل أن تستخدم الأنسجة الدهنية الطريقة التي تحتوي على الفينول.

3: تتطلب جودة التوقع بناء مكتبة شمالية ، ويتطلب بناء مكتبة cDNA تكاملًا عاليًا ، ولا يتطلب RT-PCR و RPA (مقايسة حماية Ribonuclease) تكاملًا عاليًا.يتطلب RT-PCR درجة نقاء عالية (بقايا مثبطات الإنزيم).

4: التجانس الشامل هو المفتاح لتحسين الغلة وتقليل التدهور.

5: تحقق من سلامة الكشف عن الرحلان الكهربي للـ RNA ، 28S: 18S = 2: 1 هي علامة كاملة ، 1: 1 مقبولة أيضًا لمعظم التجارب.

6: إزالة الحمض النووي لـ RT-PCR ، تحليل الصفيف من الأفضل استخدام Dnase I لإزالة الحمض النووي.

7: الحد من تلوث الأنزيمات الخارجية - لا يمكن استيراد الإنزيمات من الخارج.

8: عند تركيز حمض نووي منخفض التركيز ، يجب إضافة كاشف ترسيب مشترك.ولكن لمنع المرسب المشترك المحتوي على الإنزيمات وتلوث الحمض النووي.

9: قم بإذابة الحمض النووي الريبي تمامًا ، إذا لزم الأمر ، قم بالتسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

طريقة التخزين المناسبة

يمكن تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترة قصيرة ، وعند درجة حرارة -80 درجة مئوية لفترة طويلة.تتمثل الخطوة الأولى في تحسين إنتاجية الحمض النووي الريبي في إدراك أن محتوى الحمض النووي الريبي للعينات المختلفة يختلف اختلافًا كبيرًا.الوفرة العالية (2-4 ميكروغرام / ملجم) مثل الكبد والبنكرياس والقلب ومتوسط ​​الوفرة (0.05-2 ميكروغرام / ملجم) مثل المخ والجنين والكلى والرئة والغدة الصعترية والمبيض وانخفاض الوفرة (<0.05 ميكروغرام / ملغ) ملغ) مثل المثانة والعظام والدهون.

1: خلايا ليس لإطلاق RN - إذا لم يتم إطلاق RNA ، سيتم تقليل العائد.تعمل التجانس الكهربائي بشكل أفضل من طرق التجانس الأخرى ، ولكنها قد تحتاج أيضًا إلى الدمج مع طرق أخرى ، مثل هرس النيتروجين السائل ، والهضم الأنزيمي (الليزوزيم / الليتيكاز)

2: تحسين طريقة الاستخراج.أكبر مشاكل الطرق القائمة على الفينول هي التقسيم الطبقي غير الكامل والفقدان الجزئي للحمض النووي الريبي (لا يمكن إزالة المادة الطافية بالكامل).يرجع التقسيم الطبقي غير المكتمل إلى ارتفاع محتوى الحمض النووي والبروتين ، والذي يمكن حله عن طريق زيادة كمية المحللة المستخدمة أو تقليل كمية العينة.تمت إضافة خطوة استخراج الكلوروفورم إلى الأنسجة الدهنية.يمكن تقليل فقد الحمض النووي الريبي عن طريق الضخ العكسي أو عن طريق إزالة الطبقة العضوية متبوعة بالطرد المركزي.أكبر مشكلة مع الأساليب القائمة على الطرد المركزي العمود هي العينة الزائدة.

نصائح استخلاص كلاسيكية

1. تنقية الفينول: أضف كمية متساوية من 1: 1 فينول / كلوروفورم واخلط بقوة لمدة 1-2 دقيقة.جهاز طرد مركزي بسرعة عالية لمدة دقيقتين.قم بإزالة المادة الطافية بعناية (80-90٪).لا تصل إلى الطبقة الوسطى.يمكن إضافة حجم متساوٍ من محلول التفاعل إلى الفينول / كلوروفورم وإزالة المادة الطافية.يمكن خلط المادتين الطافيتين معًا لترسيب الحمض النووي لتحسين المحصول.لا تكن لطيفًا جدًا عند الخلط ، ولا تحاول إزالة كل المادة الطافية.

2. الغسيل بنسبة 70-80٪ من الإيثانول: أثناء الغسيل ، يجب تعليق الحمض النووي لضمان غسل الملح المتبقي.في نفس الوقت ، مباشرة بعد سكب الإيثانول ، أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية لبضع ثوان ، ثم قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة.تذوب بعد الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.

11. استخراج المنظمات الخاصة

1. الأنسجة الليفية: إن مفتاح استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة الليفية مثل عضلات القلب / الهيكل العظمي هو تعطيل الأنسجة تمامًا.تحتوي هذه الأنسجة على كثافة خلايا منخفضة ، وبالتالي فإن كمية الحمض النووي الريبي لكل وحدة وزن من الأنسجة منخفضة ، ومن الأفضل استخدام أكبر قدر ممكن من الكمية الأولية.تأكد من طحن الأنسجة جيدًا تحت ظروف التجميد.

2. الأنسجة التي تحتوي على نسبة عالية من البروتين / الدهون: نسبة الدهون في المخ / الخضار عالية.بعد استخراج PCI ، يحتوي الطاف على ندفات بيضاء.يجب إعادة استخلاص المادة الطافية بالكلوروفورم.

3. الأنسجة التي تحتوي على نسبة عالية من الحمض النووي / الريبوزيم: يحتوي الطحال / الغدة الصعترية على نسبة عالية من الحمض النووي ومحتوى الريبوزيم.يمكن لطحن الأنسجة تحت ظروف التجميد متبوعًا بالتجانس السريع أن يعطل نشاط الريبوزيمات بشكل فعال.ومع ذلك ، إذا كانت المحللة شديدة اللزوجة (بسبب المحتوى العالي للحمض النووي) ، فلن يكون استخراج PCI قادرًا على التقسيم الطبقي بشكل فعال ؛إضافة المزيد من المحللة يمكن أن يحل هذه المشكلة.يمكن أن تؤدي عمليات الاستخراج المتعددة لـ PCI إلى إزالة المزيد من الحمض النووي المتبقي.إذا تشكلت راسب أبيض مباشرة بعد إضافة الكحول ، فهذا يشير إلى تلوث الحمض النووي.يمكن أن تؤدي إعادة الاستخلاص باستخدام PCI الحمضي بعد الذوبان إلى إزالة تلوث الحمض النووي.

4. الأنسجة النباتية: الأنسجة النباتية أكثر تعقيدًا من الأنسجة الحيوانية.بشكل عام ، يتم طحن النباتات في ظل ظروف النيتروجين السائل ، لذا فإن تحلل الحمض النووي الريبي بواسطة الإنزيمات الداخلية غير شائع.إذا لم يتم حل مشكلة التدهور ، فمن شبه المؤكد أنها ناتجة عن الشوائب الموجودة في العينة.ستؤدي الشوائب الموجودة في العديد من النباتات إلى بقايا ، وغالبًا ما يكون سبب البقايا هو أن هذه الشوائب لها بعض أوجه التشابه مع الحمض النووي الريبي: أنت تترسب وأترسب ، وأنت تمتص وأمتز.تحدد هذه الخصائص أنها مثبطات إنزيم قوية جدًا.

في الوقت الحاضر ، يمكن تكييف كواشف استخراج الحمض النووي الريبي التجارية مع جميع الأنسجة الحيوانية تقريبًا مع تعديلات صغيرة ، ولكن هناك عدد قليل من كواشف استخراج الحمض النووي الريبي التجارية التي يمكن أن تكون مناسبة لمعظم الأنسجة النباتية.لحسن الحظ ، يمكن أن تقدم Foregene خاصةمجموعات استخراج الحمض النووي الريبي النباتية، لديناطقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للنبات, طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للنباتات زائد.هذا الأخير مصمم خصيصًا للنباتات التي تحتوي على نسبة عالية من السكاريد والبوليفينول.بالنسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، فإن التغذية الراجعة من مستخدمي المختبر جيدة بشكل خاص.

12. تأثير تجميد العينة والذوبان قد تكون العينة المجمدة أكبر ، ويجب قطعها قبل استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي.تميل العينات إلى الذوبان (ربما جزئيًا) أثناء القطع.قد يلزم وزن العينات المجمدة قبل استخراج الحمض النووي الريبي ، وسيحدث الذوبان بالتأكيد أثناء هذه العملية.في بعض الأحيان ، يحدث إذابة العينة أيضًا أثناء عملية طحن النيتروجين السائل ؛أو تضاف العينة المجمدة مباشرة إلى المحللة بدون طحن النيتروجين السائل ، وسيحدث الذوبان بالتأكيد قبل التجانس الكامل.أظهرت التجارب أن الأنسجة المجمدة أكثر عرضة لتلف الحمض النووي الريبي أثناء الذوبان من الأنسجة الطازجة.السبب المحتمل: تؤدي عملية التجميد-الذوبان إلى تعطيل الهياكل داخل الخلية ، مما يجعل من السهل على الإنزيمات الداخلية أن تتلامس مباشرة مع الحمض النووي الريبي.

13. الحكم على جودة الحمض النووي الريبي عادةً ما يستخدم الرحلان الكهربائي للحكم على سلامة الحمض النووي الريبي ، ويستخدم A260 / A280 للحكم على نقاء الحمض النووي الريبي.من الناحية النظرية ، يحتوي الحمض النووي الريبي السليم على نسبة 28S: 18S = 2.7: 1 ، وتؤكد معظم البيانات على نسبة 28S: 18S = 2: 1.الحقيقة هي أنه لا يوجد تقريبًا أي من الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات أخرى غير الخلايا بنسبة 2: 1 (تم الحصول على ذلك باستخدام Agilent Bioanalyzer).

تتأثر نتائج الرحلان الكهربي للحمض النووي الريبي بالعديد من العوامل ، بما في ذلك البنية الثانوية ، وظروف الرحلان الكهربي ، وحمل العينة ، ودرجة التشبع بواسطة EB ، وما إلى ذلك.إذا كان 28S عند 2kb و 18S عند 0.9kb واضحًا ، و 28S: 18S> 1 ، يمكن أن تفي النزاهة بمتطلبات معظم التجارب اللاحقة.

A260 / A280 هو مؤشر تسبب في الكثير من الالتباس.بادئ ذي بدء ، من الضروري توضيح المعنى الأصلي لهذا المؤشر للأحماض النووية: RNA النقي ، A260 / 280 = حوالي 2.0.الحمض النووي الريبي النقي هو "السبب" و A260 / A280 = 2 هو "التأثير".الآن يستخدم الجميع A260 / A280 كـ "سبب" ، معتقدين أنه "إذا كان A260 / A280 = 2 ، فإن الحمض النووي الريبي نقي" ، مما يؤدي بطبيعة الحال إلى الارتباك.

إذا كنت مهتمًا ، يمكنك إضافة القليل من الكاشف الذي غالبًا ما يستخدم في الاستخراج ، مثل الفينول ، غوانيدين أيزوثيوسيانات ، PEG ، إلخ ، إلى عينة الحمض النووي الريبي ، ثم قياس نسبة A260 / A280.الحقيقة هي أن العديد من الكواشف المستخدمة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى العديد من الشوائب في العينة ، تمتص حوالي A260 و A280 ، مما يؤثر على A260 / A280.

النهج الأكثر إفادة في الوقت الحاضر هو مسح عينات الحمض النووي الريبي في نطاق 200-300 نانومتر.منحنى RNA النقي له الخصائص التالية: المنحنى سلس ، A230 و A260 هما نقطتا انعطاف ، A300 قريب من 0 ، A260 / A280 = حوالي 2.0 ، A260 / A230 = حوالي 2.0.في حالة عدم توفر بيانات المسح ، يجب أيضًا تحديد نسبة A260 / A230 ، لأن هذه النسبة أكثر حساسية لنقل جميع الشوائب التي تؤثر على التفاعل الأنزيمي.ضع في الاعتبار النطاق الخطي للجهاز (0.1-0.5 لـ A260).

هناك ظاهرتان مفيدتان أخريان: ستكون النسبة أقل بنحو 0.3 عند قياس A260 / A280 في الماء ؛في حين أن النسبة المقاسة بـ 10 ملي مولار EDTA أعلى بحوالي 0.2 من تلك المقاسة بـ 1 ملي مولار EDTA.

منتجات ذات صله:

الصين مصنع إجمالي RNA معدات العزل الصانع والمورد |Foregene (forivd.com)

سلسلة عزل RNA الموردين والمصنع |الصين سلسلة عزل RNA مصنعين (forivd.com)

سلسلة عزل الحمض النووي الريبي - شركة Foregene المحدودة (forivd.com)