لقد كنا من ذوي الخبرة الصانع.الفوز بالأغلبية في الشهادات الحاسمة لسوقها لخصم الصين عالي الحساسية بخطوة واحدة مسبار Rt-QpcrKit V2 ، الجودة هي حياة المصنع ، والتركيز على طلب العملاء هو مصدر بقاء الشركة وتطويرها ، ونحن نلتزم بموقف العمل الصدق وحسن النية ، ونتطلع إلى قدومك!
لقد كنا من ذوي الخبرة الصانع.الفوز بالأغلبية في الشهادات الحاسمة لسوقهاChina Taq DNA Polymerase, Qpcr، وعود شركتنا: أسعار معقولة ، ووقت إنتاج قصير وخدمة ما بعد البيع مرضية ، كما نرحب بكم لزيارة مصنعنا في أي وقت تريده.أتمنى الآن أن يكون لدينا عمل ممتع وطويل الأمد معًا !!!

الأوصاف

تستخدم هذه المجموعة نظامًا عازلًا فريدًا للتحلل يمكنه إطلاق RNA بسرعة من عينات الخلايا المستزرعة لتفاعلات RT-qPCR ، وبالتالي القضاء على عملية تنقية الحمض النووي الريبي المستهلكة للوقت والشاقة.يمكن الحصول على قالب RNA في 7 دقائق فقط.يمكن لكواشف 5 × Direct RT Mix و 2 × Direct qPCR Mix-SYBR التي توفرها المجموعة الحصول بسرعة وفعالية على نتائج PCR الكمية في الوقت الفعلي.

يتمتع كل من 5 × Direct RT Mix و 2 × Direct qPCR Mix-SYBR بتسامح قوي للمثبط ، ويمكن استخدام محللة العينات كقالب لـ RT-qPCR مباشرةً.تحتوي هذه المجموعة على النسخ العكسي الفريد من نوع RNA الفريد عالي التقارب ، و Hot D-Taq DNA polymerase ، dNTPs ، MgCl₂، عازلة رد الفعل ، محسن PCR ومثبت.

تحديد

200 × 20 ميكرولتر Rxns ، 1000 × 20 ميكرولتر Rxns

مكونات الطقم

الميزات والمزايا

■ بسيط وفعال: باستخدام تقنية Cell Direct RT ، يمكن الحصول على عينات RNA في غضون 7 دقائق فقط.

■ الطلب على العينة صغير ، حيث يمكن اختبار 10 خلايا.

■ إنتاجية عالية: يمكنها اكتشاف الحمض النووي الريبي بسرعة في الخلايا المزروعة في 384 ، 96 ، 24 ، 12 ، 6 ألواح.

■ يمكن لممحاة الحمض النووي أن تزيل الجينومات التي تم إصدارها بسرعة ، وتقلل بشكل كبير من التأثير على النتائج التجريبية اللاحقة.

■ يجعل نظام RT و qPCR المحسن النسخ العكسي RT-PCR المكون من خطوتين أكثر كفاءة و PCR أكثر تحديدًا وأكثر مقاومة لمثبطات تفاعل RT-qPCR.

تطبيق كيت

نطاق التطبيق: الخلايا المستزرعة.

- الحمض النووي الريبي الصادر عن تحلل العينة: ينطبق فقط على قالب RT-qPCR لهذه المجموعة.

- يمكن استخدام المجموعة للأغراض التالية: تحليل التعبير الجيني ، والتحقق من تأثير إسكات الجينات بوساطة سيرنا ، وفحص الأدوية ، وما إلى ذلك.

رسم بياني

التخزين ومدة الصلاحية

يجب تخزين الجزء الأول من هذه المجموعة في 4 ℃ ؛يجب تخزين الجزء الثاني في -20 درجة مئوية.

يجب تخزين Foregene Protease Plus II في 4 ℃ ، لا تجمد عند -20 ℃.

الكاشف 2 × Direct qPCR Mix-SYBR يجب تخزينه عند -20 ℃ في الظلام ؛إذا تم استخدامه بشكل متكرر ، فيمكن أيضًا تخزينه في 4 ℃ للتخزين قصير الأجل (الاستخدام في غضون 10 أيام).الفوز بالأغلبية في الشهادات الحاسمة لسوقها لخصم كبير الصين عالي الحساسية من خطوة واحدة مسبار Rt-Qpcr Kit V2 ، الجودة هي حياة المصنع ، التركيز على طلب العميل هو مصدر بقاء الشركة وتطويرها ، نحن نلتزم بالأمانة وحسن النية موقف العمل ، نتطلع إلى مجيئك!
خصم كبيرChina Taq DNA Polymerase، Qpcr ، وعود شركتنا: أسعار معقولة ، ووقت إنتاج قصير وخدمة ما بعد البيع مرضية ، كما نرحب بكم لزيارة مصنعنا في أي وقت تريده.أتمنى الآن أن يكون لدينا عمل ممتع وطويل الأمد معًا !!!

QuickEعاصيTM Cell Direct RT-qPCR Kit -طقمan

القط رقم DRT-01021/01022

للخلية المباشرة RT-qPCR باستخدام ≤ 1000،000 خلية

مقدمة المنتج

يستخدم هذا المنتج نظامًا عازلًا فريدًا للتحلل لإطلاق الحمض النووي الريبي سريعًا من عينات الخلايا المستزرعة لتفاعلات RT-qPCR ، والقضاء على عملية تنقية الحمض النووي الريبي المستهلكة للوقت والشاقة ، و 7 دقائق فقط للحصول على قالب RNA المطلوب ، مع 5 × Direct RT Mix ، 2 × Direct qPCR Mix-Taqman التي توفرها المجموعة يمكن بسرعة وكفاءة الحصول على نتائج PCR الكمية في الوقت الحقيقي.

5 × Direct RT Mix و 2 × Direct qPCR Mix-Taqman يتمتعان بتسامح قوي للمثبط ويمكنهما إجراء انعكاس فعال وتضخيم محدد باستخدام محللة العينة المراد قياسها كقالب.يحتوي الكاشف على النسخ العكسي Foregene Reverse Transcriptase و Hot D-Taq DNA Polymerase و dNTPs و MgCl₂ومخزن التفاعل ومُحسِّن تفاعل البوليميراز المتسلسل ومُثبِّت ، والذي يمكن استخدامه مع محلول تحلل لاكتشاف العينات بسرعة وسهولة ، ويتميز بخصائص الحساسية العالية والنوعية والاستقرار.

مواصفات المنتج

تقنية Cell Direct RT البسيطة والفعالة والتي تستغرق 7 دقائق فقط للحصول على عينات من الحمض النووي الريبي.

متطلبات العينة صغيرة ، ويمكن استخدام ما لا يقل عن 10 خلايا مستزرعة للتجريب.

إنتاجية عالية لاكتساب الحمض النووي الريبي السريع للخلايا المستنبتة مثل لوحات 384 و 96 و 24 و 12 و 6 آبار.

يمكن لـ DNA Eraser إزالة الجينومات التي تم إصدارها بسرعة ، مما يقلل بشكل كبير من التأثير على النتائج التجريبية اللاحقة.

تتيح أنظمة RT و qPCR المُحسَّنة RT-PCR من خطوتين مع نسخ عكسي أكثر كفاءة وخصوصية وتحمل أقوى لمثبط تفاعل RT-qPCR.

تطبيق كيت

نطاق التطبيق: الخلايا المزروعة.

عينة تحليل تحليل الحمض النووي الريبي: تستخدم فقط كقالب RT-qPCR من خطوتين.

يمكن استخدام المجموعات للأغراض التالية: تحليل التعبير التنظيمي للجينات ، واختبار الأليل ، وفحص الأدوية ، وما إلى ذلك.

قيود المجموعة

شظايا مضخمة ≤ 300 نقطة أساس.

تستخدم مجموعات لاستنبات الخلايا حديثًا.

مراقبة جودة المنتج

وفقًا لنظام إدارة الجودة الشاملة من FOREGENE ، يتم اختبار كل دفعة من مجموعات مجموعات سلسلة Cell Direct RT-qPCR بصرامة عدة مرات لضمان موثوقية واستقرار جودة كل دفعة من المجموعات.

محتويات المجموعة

*:يمكن شراء تحلل الخلية ، 5 × Direct RT Mix ، 2 × Direct qPCR Mix-Taqman بشكل منفصل ، وترد التفاصيل في الملحق 1 (الصفحة 13).

شروط التخزين

1. شروط الشحن

العملية الكاملة لنقل علبة الثلج ذات درجة الحرارة المنخفضة ، للتأكد من أن المجموعة في حالة <4 درجة مئوية.

2. شروط التخزين

قم بتخزين الجزء الأول عند 4 درجات مئوية والجزء الثاني عند -20 درجة مئوية.

يجب تخزين Foregene Protease Plus II عند 4 درجات مئوية ، وليس مجمداً عند -20 درجة مئوية.

يتم تخزين الكاشف 2 × مباشرة qPCR Mix-Taqman عند -20 درجة مئوية ، أو عند 4 درجات مئوية للاستخدام قصير المدى إذا تم استخدامه بشكل متكرر (خلال 10 أيام).

معلومات مكون الطقم

Buffer CL: يوفر البيئة اللازمة لتفاعلات تحلل الخلايا.

Buffer ST: ينهي المادة الفعالة في المحللة لتجنب التأثيرات على RT اللاحقة.

ممحاة الحمض النووي: مزيل الحمض النووي ، تأثير إزالة الجينوم على التجارب اللاحقة.

5 × Direct RT Mix: يحتوي على نسبة عالية من تقارب RNA Foregene Reverse Transcriptase ، ومانع RNase ، و dNTPs ، ومثبتات ، ومحسنات ، ومحسنات ، وأشعال النسخ العكسي للمحاذاة المثلى (Random Primer ، Oligo (dT)₁₈التمهيدي).

Foregene Protease Plus II: في سياق المخزن المؤقت للتحلل ، يتم تفكيك الخلايا لإطلاق الأحماض النووية.

2 × qPCR Mix-Taqman المباشر: يحتوي هذا الكاشف على Hot D-Taq DNA Polymerase و dNTPs و MgCl₂، عازلة رد الفعل ، محسن PCR ، ومثبت.

20 × صبغة مرجعية ROX: تستخدم بشكل عام في أدوات تضخيم PCR في الوقت الحقيقي من ABI و Stratagene وشركات أخرى ، يتم استخدامها لضبط الفرق بين أنابيب وأنابيب PCR الناتجة عن أخطاء جرعات PCR.يختلف تركيز الصبغة المرجعية 20 × ROX المطلوب للأدوات المختلفة ، ويمكن للمستخدم إضافته وفقًا للتركيز الموصى به للأداة.

RNase خالية ddH₂O: ماء فائق النقاء وخالي من RNase لتفاعلات RT-qPCR من خطوتين.

احتياطات:(تأكد من قراءة الاحتياطات بعناية قبل استخدام المجموعة)

انتبه إلى طريقة تشغيل التجربة لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.

انتبه إلى نظافة البيئة والأواني التجريبية لتجنب تلوث RNase وتدهور الحمض النووي الريبي.

خذ عينات خلايا جديدة أو محفوظة جيدًا ولا تستخدم أبدًا عينات خلايا مذابة بالتجميد متكررة.

5 × qPCR Mix المباشر ، 2 × يجب أن يتجنب qPCR Mix-Taqman المباشر ذوبان الجليد المتكرر ، وإلا فإنه سيؤثر على النسخ العكسي وكفاءة PCR.

بريباحصصقبلعملية

تأكد من قراءة التعليمات بعناية قبل استخدام هذه المجموعة.تعتبر مجموعة Cell Direct RT-qPCR بسيطة ومريحة وسريعة التشغيل ، وتوفر الإرشادات معلومات كاملة حول المجموعة بأكملها وكيفية استخدامها بشكل صحيح.يرجى تحضير المواد والمعدات التجريبية اللازمة قبل الاستخدام.

المواد والمعدات التجريبية

◆ خلايا الثقافة.

1.5 مل أو 2 مل ، أنبوب طرد مركزي خالٍ من RNase / DNase ، طرف خالٍ من RNase / DNase ، أنبوب qPCR معقم 0.2 مل.

◆ آلة qPCR ، ماصة ، جهاز طرد مركزي منضدية (≥13400×ز) (حسب الاحتياجات التجريبية) ، إلخ.

أمان

◆ هذا المنتج لأغراض البحث العلمي فقط ، يرجى عدم استخدامه للأغراض الصيدلانية والسريرية والغذائية والتجميلية.

◆ عند استخدام المواد الكيميائية ، ارتد ملابس المختبر المناسبة والقفازات والنظارات الواقية وما إلى ذلك.

عمليةخطوط إرشاد

يمكن شراء أنظمة تحلل الخلايا وأنظمة RT وحزم مكملات محلول تفاعل qPCR بشكل منفصل للحصول على التفاصيل في الملحق 1 (الصفحة 13).

دليل العمليه

ج: إطلاق عينة من الحمض النووي الريبي

1 - تم معالجة الخلايا مسبقًا: اغسل صفيحة استنبات الخلية ببرنامج تلفزيوني بارد ، ثم اغسل الخلايا (10-10⁶) ، 10⁶ من كمية الخلايا ، يوصى بـ Foregene الخلية ومجموعة RNA Isolation Kit (DE-03111) أو مجموعة عزل RNA المجموع الحيواني (DE-03011) لاستخراج وتنقية الحمض النووي الريبي.

1.1الخلايا الملتصقة (24- لوحة جيدة كمثال)

1.1.1.حدد عدد الخلايا في كل بئر ، وحدد أن عدد الخلايا هو 1 × 10⁵، واستخدام ماصة لإزالة وسط الثقافة من طبق الثقافة.

1.1.2.أضف 200 ميكرولتر من 1 × برنامج تلفزيوني مبرد مسبقًا لكل بئر.لا تستخدم الماصة بشكل متكرر وإزالة برنامج تلفزيوني من الآبار.قم بإمالة اللوحة وإزالة أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني.انتقل إلى الخطوة 2.

1.1.3.تمت إضافة طبق زراعة خلية مختلف أو جدول رقم مرجعي 1-1 في طبق ثقافة الخلية مبرد مسبقًا 1 × PBS لغسل الخلايا.

الجدول 1-1: جرعة PBS لأعداد مختلفة من الخلايا

ملحوظة：لضمان أن تكون الخلايا ملتصقة，تجنب عدد كبير من فقدان الخلايا عند الغسيل.

1.2الخلايا المعلقة أو الخلايا الملتصقة المزروعة في ألواح غير مسامية

1.2.1.الخلايا الملتصقة المزروعة في لوحات غير متعددة الآبار (تبدأ الخلايا المعلقة من الخطوة التالية 1.2.2) ، وتجمع الخلايا وتفصلها وفقًا لطريقة جمع الخلايا العادية ، وتضعها في لوحة الثقافة أو أنبوب الطرد المركزي ؛إذا تم استخدام التربسين ، تتطلب الطرد المركزي لجمع الخلايا وإزالة التربسين المتبقية ، إضافة الخلايا المعلقة PBS إلى الخلايا الفردية لتفريق الخلايا.

1.2.2.بعد عدد الخلايا المحسوبة ، الخلايا المقطوعة 1 × 10⁵ واحد لأنابيب الطرد المركزي ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق.

1.2.3.إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لأنبوب الطرد المركزي ، لا ماصة مرارا وتكرارا ، ونضح مباشرة في برنامج تلفزيوني.انتقل إلى الخطوة 2. (إذا كان من الصعب التعجيل وتم إعادة تعليق الخلايا مرة أخرى ، فيمكن إجراء طرد مركزي بمقدار 1000 × جم بعد 10 دقائق من التخلص من المادة الطافية ، وتنتقل حبيبة الخلية إلى الخطوة 2)

2- تحلل الخلية: إزالة Buffer CL ، درجة حرارته متوازنة مع درجة حرارة الغرفة ، DNA Eraser و Foregene Protease Plus II ، وفقًا للجدول التالي 1-2 نظام التحلل المحضر: (محلول التحلل جاهز للاستخدام).

جدول 1-2: انشقاق إعداد النظام (ملاحظة: في التحضير على الجليد)

3. (24- لوحة جيدة كمثال) ماصة 200 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتحلل الخلية في كل بئر ، النفخ بشكل متكرر 5-10 مرات ، احتضان في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.

ملحوظة：لتجنب تكون الفقاعات ، يرجى عند تعديل مقياس الماصة إلى 200 ميكرولتر أو أقل.قد تظهر الخلايا غائمة بعد التحلل ، وهو أمر طبيعي.

4. (24- لوحة جيدة كمثال) يضاف في السائل 20 ميكرولتر العازلة ST (أنظمة تحلل مختلفة تمت إضافة المخزن المؤقت ST بالمقدار المبين في الجدول 1-3) ، تكرار الماصات 5-10 مرات ، في درجة حرارة الغرفة (20-25 ℃) تم تحضينها لمدة دقيقتين.

ملحوظة：يتم التخلص من طرف الماصة تحت السطح ، مما يضمن إضافة المحللة，لتجنب تكون الفقاعات ، يرجى عند تعديل مقياس الماصة إلى 200 ميكرولتر أو أقل.

الجدول 1-3：إضافة العازلة ST

5 يتم استخدام المحللة في تجارب RT-qPCR اللاحقة.إذا تعذر إجراء التجارب اللاحقة في الوقت المناسب ، فيرجى الاحتفاظ بها على الجليد لمدة لا تزيد عن ساعتين ، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية (لا تزيد عن ثلاثة أشهر).

ب: إعداد نظام RT

1.اخرج 5 × Direct RT Mix ووضعه في حمام جليدي ، واتركه يذوب بشكل طبيعي ، واخلطه برفق لاستخدامه لاحقًا ؛أخرج ddH2O الخالي من RNase وأذوبه وضعه في حمام جليدي لاستخدامه لاحقًا.قم بإعداد نظام التفاعل على الجليد وفقًا للجدول 2-1 أدناه.

الجدول 2-1: إعداد نظام رد فعل RT

2. بعد الانتهاء من صياغة النظام ، يخلط بلطف مع الطرد المركزي لفترة وجيزة في الجدول التالي 2 -2 ظروف رد فعل RT رد فعل.

الجدول 2-2: ضبط شرط رد فعل RT

3. بعد الانتهاء من التفاعل ، تم وضع منتج التفاعل مباشرة على الجليد من أجل qPCR ، يرجى وضع الحفظ طويل الأمد -20 ℃ أو -80 ℃.

ملاحظة: بسبب استخدام قالب غير منقى ، قد تظهر رواسب بيضاء في منتج النسخ العكسي.هذه ظاهرة طبيعية.الطرد المركزي طاف على الفور للتجارب اللاحقة.

يضاف محلول تفاعل RT الناتج إلى أنظمة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي للخطوة التالية ، يوصى بإضافة كميات تتراوح من 10 إلى 30٪ من نظام التفاعل.

C: إعداد نظام رد فعل qPCR

1. كمية مناسبة من B أعدت في خطوة قالب (كدنا) وفقا للجدول التالي 3-1 لإعداد نظام رد فعل.

ملاحظة: كمية قالب cDNA تمثل 10-30٪ من نظام qPCR.على سبيل المثال ، في نظام qPCR 20 مايكرولتر ، أضف 2-6 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، ولكن ليس أكثر من 6 ميكرولتر.

2. شروط qPCR الجيدة (درجة حرارة التلدين ， إلخ) لتفاعل qPCR (شروط التفاعل الواردة في الجدول 3-2).

ملاحظة: حاول استخدام الظروف المثلى لتفاعلات qPCR للحصول على نتائج أفضل.

الجدول 3-1: إعداد نظام تفاعل PCR

1 *: يمكن تعديل تركيز التمهيدي في نطاق 50-900 نانومتر عندما يكون أداء تفاعل التمهيدي ضعيفًا.

ملاحظة: يمكن تعديل نظام qPCR وفقًا للاحتياجات التجريبية ونموذج cycler الفلوري.ل qPCR في 50μنظام l ، اضبط جرعة الكاشف بالتناسب وفقًا لـ 20μنظام ل.

2 *: حدد التركيز النهائي المناسب للصبغة المرجعية ROX وفقًا للدوران الحراري الكمي الفلوري.يتم عرض تركيزات الصبغة المرجعية الأكثر ملاءمة ROX لدوارات كمية مضان شائعة في الجدول أدناه:

الجدول 3-2: يتم توفير شروط تفاعل qPCR

ملاحظة: من أجل الحصول على أفضل تأثير qPCR ، يمكن استخدام التدرج PCR لتحسين ظروف التفاعل لقوالب مختلفة وأشعال مختلفة.تختلف ظروف تفاعل PCR اعتمادًا على محلل التألق ، والقالب ، والتمهيدي ، وما إلى ذلك. في العملية المحددة ، يجب تصميم ظروف التفاعل المثلى وفقًا للظروف المحددة للدوران الحراري الكمي الفلوري ، ونوع القالب ، وحجم جزء الاهتمام ، والتسلسل الأساسي للجزء المضخم ومحتوى GC وطول الاشعال ، بما في ذلك درجة حرارة التلدين ، ووقت التفاعل ، وما إلى ذلك.

مبادئ تصميم الوقت الحقيقي PCR التمهيدي

التمهيدي الأمامي والعكس التمهيدي

بالنسبة لـ Real Time PCR ، يعد التصميم التمهيدي مهمًا جدًا.ترتبط المواد الأولية بخصوصية وكفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويمكن تصميمها بالرجوع إلى المبادئ التالية:

◆ طول التمهيدي: 18-30 نقطة أساس.

◆ محتوى GC: 40-60٪.

◆ قيمة Tm: يمكن لبرنامج تصميم Primer ، مثل Primer 5 ، أن يعطي قيمة Tm للبرايمر.يجب أن تكون قيم Tm للاشعال في المنبع والمصب أقرب ما يمكن.يمكن أيضًا استخدام صيغة حساب Tm: Tm = 4 ° C (G + C) + 2 ° C (A + T).عند إجراء PCR ، يتم تحديد درجة حرارة أقل من قيمة Tm التمهيدي البالغة 5 درجات مئوية كدرجة حرارة التلدين (يمكن أن تؤدي الزيادة المقابلة في درجة حرارة التلدين إلى زيادة خصوصية تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل).

◆ مواد أولية ومنتجات PCR:

يفضل أن يكون طول منتج تضخيم PCR التمهيدي 100-150 نقطة أساس.

يجب تجنب استخدام البادئات التصميمية في المنطقة الهيكلية الثانوية للقالب قدر الإمكان.

◆ تجنب تكوين قاعدتين أو أكثر من القواعد التكميلية بين النهايات 3 من البادئات المنبع والمصب.

◆ لا يمكن أن توجد القاعدة الطرفية التمهيدي 3 مع 3 G أو C.

◆ لا يمكن أن تحتوي البادئات نفسها على هياكل مكملة ، وإلا فسيتم تكوين هيكل دبوس الشعر ، مما يؤثر على تضخيم PCR.

◆ يجب توزيع ATCG بالتساوي قدر الإمكان في تسلسل التمهيدي ، ويجب تجنب القاعدة الطرفية 3 مثل T.

زائدة1：Cell مباشرRT-QPCR مكونات المجموعةر حزمة المكملات

1- محلول تحلل الخلية