من المعروف أن الحمض النووي الريبي في العقيدة المركزية هو الوسيط النسخي بين الحمض النووي وتعبير البروتين.مقارنة باكتشاف الحمض النووي ، يمكن أن يعكس اكتشاف الحمض النووي الريبي بشكل أكثر موضوعية التعبير الجيني في الكائنات الحية.تشمل التجارب التي تتضمن RNA: qRT-PCR و RNA-Seq واكتشاف الجينات الاندماجية ، وما إلى ذلك استنادًا إلى خصائص الحمض النووي الريبي نفسه (تحتوي حلقة السكر في الحمض النووي الريبي على مجموعة هيدروكسيل حرة أكثر من حلقة السكر في الحمض النووي) ، إلى جانب عدد كبير من RNases في البيئة ، فإن الحمض النووي الريبي أكثر استقرارًا وأسهل في التحلل من الحمض النووي.قمامة في ، قمامة ، إذا كانت جودة الحمض النووي الريبي ليست جيدة ، فيجب أن تكون النتائج التجريبية غير مرضية ، وتتجلى على وجه التحديد على أنها بيانات غير دقيقة أو ضعف في التكرار.لذلك ، ينبغي إيلاء المزيد من الاهتمام لمعالجة الحمض النووي الريبي ، كما أن ارتباط مراقبة الجودة أكثر أهمية لضمان دقة ودقة البيانات التجريبية اللاحقة.

لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي ، توجد بشكل عام الطرق التالية شائعة الاستخدام:

• قياس الطيف الضوئي
• الاغاروز الكهربائي للهلام
• Agilent Bioanalyzer
• في الوقت الحقيقي الفلورسنت الكمي PCR
• طريقة صبغة كيوبت الفلورية

01 قياس الطيف الضوئي

يحتوي الحمض النووي الريبي على روابط مزدوجة مترافقة ولها ذروة امتصاص بطول موجة يبلغ 260 نانومتر.وفقًا لقانون لامبرت بير ، يمكننا حساب تركيز الحمض النووي الريبي من ذروة الامتصاص عند 260 نانومتر.بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا أيضًا حساب نقاء الحمض النووي الريبي وفقًا لنسبة قمم الامتصاص 260 نانومتر و 280 نانومتر و 230 نانومتر.280 نانومتر و 230 نانومتر هما ذروة امتصاص البروتينات والجزيئات الصغيرة ، على التوالي.يجب أن تكون نسبة A260 / A280 و A260 / A230 لنقاء RNA المؤهل أكبر من 2. إذا كانت أقل من 2 ، فهذا يعني أن هناك تلوثًا بالبروتين أو الجزيء الصغير في عينة RNA ويجب تنقيته مرة أخرى.ستؤثر مصادر التلوث على التجارب النهائية ، مثل تثبيط كفاءة التضخيم لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يؤدي إلى نتائج كمية غير دقيقة.نقاوة الحمض النووي الريبي لها تأثير كبير على النتائج اللاحقة ، لذا فإن القياس الطيفي بشكل عام هو رابط لا غنى عنه لمراقبة الجودة في الخطوة الأولى في تجارب الحمض النووي.

الشكل 1. طيف امتصاص الحمض النووي الريبي النموذجي / الحمض النووي

02 الاغاروز الكهربائي للهلام

بالإضافة إلى النقاء ، فإن سلامة الحمض النووي الريبي هي أيضًا أحد المؤشرات المهمة للحكم على جودة الحمض النووي الريبي.سيؤدي تدهور الحمض النووي الريبي إلى عدد كبير من الأجزاء القصيرة في العينة ، وبالتالي سيتم تقليل عدد شظايا الحمض النووي الريبي التي يمكن اكتشافها بشكل فعال وتغطيتها بالتسلسل المرجعي.يمكن التحقق من سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي لمجموع الحمض النووي الريبي على هلام الاغاروز 1٪.يمكن لهذه الطريقة تكوين الجل بنفسك ، أو استخدام نظام E-Gel ™ الجاهز لاختبار السلامة.أكثر من 80 ٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي هو RNA الريبوزومي ، ويتكون معظمها من 28S و 18S rRNA (في أنظمة الثدييات).سيُظهر الحمض النووي الريبي عالي الجودة شريطين ساطعين واضحين ، وهما 28S و 18 S ، على التوالي ، عند 5 كيلو بايت و 2 كيلو بايت ، وستكون النسبة قريبة من 2: 1.إذا كانت في حالة منتشرة ، فهذا يعني أن عينة الحمض النووي الريبي ربما تكون قد تدهورت ، ويوصى باستخدام الطريقة الموضحة لاحقًا لمزيد من اختبار جودة الحمض النووي الريبي.

الشكل 2. مقارنة بين الرنا المتدهور (الممر 2) والحمض النووي الريبي السليم (الممر 3) على الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز

03 محلل بيولوجي Agilent

بالإضافة إلى طريقة الاغاروز الكهربائي للهلام الموصوفة أعلاه ، والتي يمكن أن تساعدنا في تحديد سلامة الحمض النووي الريبي ببساطة وبسرعة ، يمكننا أيضًا استخدام المحلل الحيوي Agilent لتحديد سلامة الحمض النووي الريبي.يستخدم مزيجًا من الموائع الدقيقة ، والرحلان الكهربائي الشعري ، والفلورة لتقييم تركيز وسلامة الحمض النووي الريبي.باستخدام الخوارزمية المدمجة لتحليل ملف تعريف عينة RNA ، يمكن للمحلل الحيوي Agilent حساب قيمة سلامة RNA المرجعية ، رقم تكامل RNA (المشار إليه فيما يلي باسم RIN) [1].كلما زادت قيمة RIN ، زادت سلامة RNA (1 متدهور للغاية ، 10 هو الأكثر اكتمالًا).تقترح بعض التجارب التي تتضمن RNA استخدام RIN كمعامل لتقييم الجودة.بأخذ تجارب التسلسل عالية الإنتاجية (المشار إليها فيما يلي باسم NGS) كمثال ، فإن إرشادات Oncomine ™ Human Immune Repertoire ، والتي تُستخدم للكشف عن مستقبلات مستضد الخلايا B و T في سلسلة لوحات Oncomine الخاصة بـ Thermo Fisher ، تشير إلى أنه يمكن قياس العينات التي تحتوي على قيم RIN أكبر من 4 ، وقراءات أكثر فاعلية واستنساخًا (الشكل 3).هناك نطاقات مختلفة موصى بها للوحات مختلفة ، وغالبًا ما يمكن أن يؤدي استخدام RIN الأعلى إلى توفير بيانات أكثر فاعلية.

الشكل 3 ، في تجارب مرجع المناعة البشرية Oncomine ™ ، يمكن للعينات التي تحتوي على RIN أكبر من 4 اكتشاف قراءات أكثر فاعلية واستنساخ الخلايا التائية.【2】

ومع ذلك ، فإن قيمة RIN لها أيضًا بعض القيود.على الرغم من أن RIN لها ارتباط كبير بجودة بيانات NGS التجريبية ، إلا أنها غير مناسبة لعينات FFPE.تمت معالجة عينات FFPE كيميائيًا لفترة طويلة ، ويكون للحمض النووي الريبي المستخرج بشكل عام قيمة RIN منخفضة نسبيًا.ومع ذلك ، هذا لا يعني أن البيانات الفعالة للتجربة يجب أن تكون غير مرضية.لتقييم جودة عينات FFPE بدقة ، نحتاج إلى استخدام قياسات أخرى غير RIN.بالإضافة إلى RIN ، يمكن للمحلل الحيوي Agilent أيضًا حساب قيمة DV200 كمعامل تقييم لجودة RNA.DV200 هي معلمة تحسب نسبة الأجزاء الأكبر من 200 نقطة أساس في عينة RNA.DV200 هو مؤشر أفضل لجودة عينة FFPE من RIN.بالنسبة للحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة FFPE ، فإنه يرتبط ارتباطًا وثيقًا بعدد الجينات التي يمكن اكتشافها بشكل فعال وتنوع الجينات [3].على الرغم من أن DV200 يمكنه تعويض أوجه القصور في الكشف عن جودة FFPE ، إلا أن المحلل الحيوي Agilent لا يزال غير قادر على تحليل مشاكل الجودة في عينات الحمض النووي الريبي بشكل شامل ، بما في ذلك ما إذا كانت هناك مثبطات في العينات.يمكن أن تؤثر المثبطات نفسها على كفاءة التضخيم لتجارب المصب وتقليل كمية البيانات المفيدة.لمعرفة ما إذا كان هناك مثبط في العينة ، يمكننا اعتماد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي الموصوفة لاحقًا.

04 في الوقت الحقيقي الفلورسنت الكمي PCR

لا يمكن لطريقة PCR الكمية الفلورية في الوقت الحقيقي اكتشاف المثبطات في العينة فحسب ، بل تعكس أيضًا جودة الحمض النووي الريبي في عينة FFPE بدقة.بالمقارنة مع أجهزة التحليل البيولوجي Agilent ، فإن الأدوات الكمية في الوقت الحقيقي الفلورية أكثر شيوعًا في المختبرات البيولوجية الكبرى بسبب تطبيقها على نطاق أوسع.لاختبار جودة عينات الحمض النووي الريبي ، نحتاج فقط إلى شراء أو تحضير مجسات أولية للجينات المرجعية الداخلية ، مثل GUSB (Cat no. Hs00939627).باستخدام هذه المجموعة من الاشعال والتحقيقات والمعايير (إجمالي الحمض النووي الريبي لتركيز معروف) لإجراء تجارب كمية مطلقة ، يمكن حساب تركيز جزء الحمض النووي الريبي الفعال كمعيار تقييم جودة الحمض النووي الريبي (الكميات الوظيفية للحمض النووي الريبي (FRQ) باختصار).في اختبار NGS ، وجدنا أن FRQ لعينات الحمض النووي الريبي لها ارتباط كبير جدًا بحجم البيانات الفعال.بالنسبة لجميع العينات التي يزيد حجمها عن 0.2ng / uL FRQ ، يمكن أن تغطي 70٪ على الأقل من القراءات بشكل فعال التسلسل المرجعي (الشكل 4).

الشكل 4 ، قيمة FRQ التي تم الكشف عنها بواسطة الطريقة الكمية الفلورية لها علاقة عالية جدًا (R2> 0.9) مع البيانات الفعالة التي تم الحصول عليها في تجربة NGS.الخط الأحمر هو قيمة FRQ التي تساوي 0.2 نانوغرام / uL (log10 = -0.7).【4】

بالإضافة إلى كونها قابلة للتطبيق على عينات FFPE ، يمكن لطريقة PCR الكمية في الوقت الحقيقي أيضًا مراقبة المثبطات في العينات بشكل فعال.يمكننا إضافة العينة المراد اكتشافها في نظام التفاعل باستخدام التحكم الإيجابي الداخلي (IPC) والمقايسة الخاصة به ، ثم إجراء القياس الكمي للفلورة للحصول على قيمة Ct.إذا تأخرت قيمة Ct عن قيمة Ct في تفاعل عدم وجود عينة ، فإنها تشير إلى أن المانع موجود في العينة ويثبط كفاءة التضخيم في التفاعل.

05 طريقة صبغ كيوبت الفلوريسنت

Qubit Fluorometer هو الجهاز الصغير الأكثر استخدامًا لتركيز الحمض النووي واكتشاف النقاء ، وهو سهل التشغيل وموجود في كل مختبر بيولوجيا جزيئية تقريبًا.يقوم بحساب تركيز الحمض النووي بدقة عن طريق الكشف عن الصبغة الفلورية المرتبطة بالحمض النووي (كاشف Qubit).تتمتع Qubit بحساسية وخصوصية عالية ، ويمكنها تحديد كمية الحمض النووي الريبي بدقة وصولاً إلى تركيز بيكوغرام / ميكرولتر.بالإضافة إلى القدرة المعروفة على التحديد الكمي الدقيق لتركيز الحمض النووي ، فإن أحدث طراز جديد من Thermo Fisher ، Qubit 4.0 ، يمكنه أيضًا اكتشاف سلامة الحمض النووي الريبي.يكتشف نظام الكشف عن RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق الكشف في وقت واحد عن اثنين من أصباغ الفلورسنت المحددة.يمكن لهذين الأصباغ الفلورية الارتباط بشظايا كبيرة وشظايا صغيرة من الحمض النووي الريبي ، على التوالي.يشير هذان اللونان الفلوريان إلى نسبة الأجزاء الكبيرة من الحمض النووي الريبي في العينة ، ومن هذا يمكن حساب قيمة IQ (النزاهة والجودة) التي تمثل جودة الحمض النووي الريبي.تنطبق قيمة معدل الذكاء على عينات FFPE وغير FFPE ، ولها تأثير كبير على جودة التسلسل اللاحقة.بأخذ تجارب NGS كمثال ، في تجارب اختبار RNA-Seq التي أجريت على منصة Ion torrent ™ ، كانت معظم العينات التي تحتوي على قيم معدل ذكاء أكبر من 4 قراءات فعالة بنسبة 50 ٪ على الأقل (الشكل 5).بالمقارنة مع طرق الكشف المذكورة أعلاه ، فإن Qubit IQ Assay ليس فقط أكثر ملاءمة للعمل ويستغرق وقتًا أقل (في غضون خمس دقائق) ، ولكن له أيضًا ارتباط كبير بين قيمة معامل الذكاء المقاس وجودة البيانات للتجارب النهائية.

الشكل 5 ، هناك ارتباط كبير بين قيمة Qubit RNA IQ والقراءات المعينة لـ RNA-Seq.5

من خلال المقدمة أعلاه ، أعتقد أن كل شخص لديه فهم كاف لطرق مختلفة لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي.في الممارسة العملية ، يمكنك الاختيارالطريقة المقابلة وفقًا لنوع العينة والأدوات الموجودة.فقط من خلال التحكم في جودة RNA جيدًا يمكننا تجنب فشل التجارب اللاحقة بسبب جودة العينة الرديئة ، وبالتالي توفير الوقت الثمين والطاقة والتكلفة.

المنتجات المرجعية:

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للحيوان

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للخلايا

مراجع

^ 1 ، شرودر ، أ ، مولر ، أو. ، ستوكر ، س وآخرون.RIN: رقم تكامل RNA لتعيين قيم التكامل لقياسات RNA.BMC الجزيئي بيول 7 ، 3 (2006).https:// doi .org / 10.1186 / 1471-21 99-7-3

【2】 دليل مستخدم مرجع جهاز المناعة البشري Oncomine (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 ليا سي ويماس ، تشارلز إي وود ، براين إن كورلي ، كارول إل يوك ، جيل إم نيلسون ، سوزان دي هيستر ، مقاييس الجودة المحسنة لتقييم الحمض النووي الريبي المشتق من عينات الأنسجة المثبتة بالفورمالين المثبتة بالبارافين ، علوم السموم ، المجلد 170 ، العدد 2 ، أغسطس 2019 ، الصفحات 357-37https://doi.org/10.1093/toxsci/