Escherichia Coli O157: H7 مجموعة الكشف عن الأحماض النووية (طريقة المسبار الفلوري PCR / التجفيف بالتجميد)
وصف المجموعة:
القط.FP103
يتم استخدامه للكشف والفحص السريع للإشريكية القولونية O157: H7 في الأغذية والأعلاف وعينات المياه والعينات البيئية.
الأوصاف
يتم استخدامه لالكشف والفحص السريع للإشريكية القولونية O157: H7 في الأغذية والأعلاف وعينات المياه والعينات البيئية.
[مبدأ الاختبار]
وفقًا لمبدأ تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلوريسنت ، تم تصميم بادئات محددة وتحقيقات Taqman للجين المحدد لـ Escherichia coli O157: H7 ، وتم الكشف عنها بواسطة أداة PCR الفلورية ، وذلك لتحقيق اكتشاف Escherichia coli O157: H7 الكشف النوعي للحمض النووي.
محتويات المجموعة
ملاحظة: لا يتم تضمين مسبار قناة ROX.
| Cمكونات | تخصيص | Qالكمية |
| العازلة أ | أنبوب | 1 |
| العازلة ب | أنبوب | 1 |
| مراقبة إيجابية | أنبوب | 1 |
| سيطرة سلبية | أنبوب | 1 |
الاستخدام المتوقع
يتم استخدامه ل الكشف والفحص السريع للإشريكية القولونية O157: H7 في الأغذية والأعلاف وعينات المياه والعينات البيئية.
شروط التخزين وتاريخ انتهاء الصلاحية
يحفظ في درجة حرارة -20 ℃ في الظلام وتجنب التجميد والذوبان المتكرر.
فترة الصلاحية هي 12أشهر ، ويظهر تاريخ الإنتاج على العبوة الخارجية.
الأدوات والمواد الاستهلاكية
أداة PCR الكمي الفلورية ، مسدس ماصة ونصائح مطابقة ، شاكر دوامة ، جهاز طرد مركزي صغير.
إستعمال
1. معالجة العينات
1.1 نوع العينة: هذه المجموعة مناسبة للأغذية والأعلاف وعينات المياه والعينات الأخرى المشتبه في تلوثها بالإشريكية القولونية O157: H7.بالنسبة لمنتجات اللحوم المعالجة بعمق ، والمشروبات وغيرها من المواد التي تحتوي على أصباغ ، يجب شطفها لتجنب التأثير على مجموعة إشارات التألق.
1.2 معالجة العينة: ارجع إلى "GB 4789.10-2016 الفحص الميكروبيولوجي للأغذية المعيارية الوطنية لسلامة الأغذية لاختبار الإشريكية القولونية O157: H7" لتحضير العينة ، وثقافة الإثراء وعزل الإشريكية القولونية O157: H7.
- Nاستخراج حمض اليوكليك
خذ 20 مل من محلول التخصيب في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وأضف 200 ميكرولتر من المحللة الميكروبية (مطلوب مجموعة إضافية) ، ودوامة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ، ووضعها جانباً.
ملاحظات: يجب أن يكتمل استخراج الحمض النووي من المحللة في غضون 10 دقائق ، ولا يمكن تخزينه لفترة طويلة.
3. تضخيم الحمض النووي
3.1 قم بتشغيل أداة PCR الكمية الفلورية للاستخدام.
المخزن المؤقت A و Buffer B من المجموعة ، قم بإذابهما جيدًا ، ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة.إضافة 18 ميكرولتر العازلة A و 2 ميكرولتر B العازلة لكل أنبوب تفاعل PCR.ثم أضف 5 مل كل عنصر تحكم سلبي ، وحمض نووي مستخرج ، وتحكم إيجابي في أنابيب تفاعل PCR ، وغطاء الأنابيب ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
3.3 قم بنقل أنبوب تفاعل PCR إلى آلة PCR الفلورية ، واستخدم الإجراءات التالية لإجراء تجارب التضخيم: حدد 25 مل لنظام التفاعل ، وجمع إشارات التألق عند 60 درجة مئوية لكل دورة ، وحدد FAM لقناة الكشف.
| خطوة | برنامج | عدد الدورات |
| 1 | 37 ℃ 5 دقائق | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 دقيقة | 1 |
| 3 | 95 درجة مئوية 15 ثانية | 4 0 |
| 60 30 ثانية (تجميع الفلورة) |
أدلة لتحليل المشاكل
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
لا يمكن استخلاص الحمض النووي الريبي أو أن إنتاج الحمض النووي منخفض
عادة ما يكون هناك العديد من العوامل التي تؤثر على كفاءة الاسترداد ، مثل: عينة محتوى الحمض النووي الريبي ، وطريقة التشغيل ، وحجم الشطف ، وما إلى ذلك.
تحليل الأسباب الشائعة ：
1- حمام ثلجي أو طرد مركزي بدرجة حرارة منخفضة (4 درجات مئوية) أثناء التشغيل.
اقتراح: تشغيل بدرجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) ، لا تستخدم حمامًا جليديًا أو أجهزة طرد مركزي ذات درجة حرارة منخفضة.
2. تخزين العينة بشكل غير صحيح أو تخزين العينة لفترة طويلة جدًا.
اقتراح: تخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو تجميدها في النيتروجين السائل ، وتجنب الاستخدام المتكرر للتجميد والذوبان ؛حاول استخدام العينات التي تم جمعها حديثًا لاستخراج الحمض النووي الريبي.
3- تحلل العينة غير الكافي
توصية: يرجى التأكد من أن العينة ومحلول العمل (الأكريلاميد الخطي) قد تم خلطهما جيدًا واحتضانهما لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية)
4-تمت إضافة eluent بشكل غير صحيح
توصية: تأكد من إضافة ddH2O الخالي من RNase إلى منتصف غشاء عمود التنقية
5. حجم غير مناسب من الإيثانول اللامائي في المخزن المؤقت viRW2
اقتراح: يرجى اتباع التعليمات وإضافة الحجم الصحيح من الإيثانول اللامائي إلى Buffer viRW2 وخلطها جيدًا قبل استخدام المجموعة。
6. الاستخدام غير السليم للعينة.
الاقتراح: 200 ميكرولتر من العينة لكل 500 ميكرولتر من Buffer viRL.سيؤدي حجم العينة الزائد إلى انخفاض معدل استخراج الحمض النووي الريبي.
7. حجم الشطف غير السليم أو شطف غير كامل.
اقتراح: الحجم الصغير لعمود التنقية هو 30-50 مايكرولتر ؛إذا كان تأثير الشطف غير مرضٍ ، يوصى بإضافة RNase-free ddH المسخن مسبقًا2قم بتمديد وقت وضعه في درجة حرارة الغرفة ، مثل 5-10 دقائق
8. يحتوي عمود التنقية على بقايا إيثانول بعد الشطف في Buffer viRW2.
اقتراح: إذا بقي الإيثانول بعد الشطف في Buffer viRW2 والطرد المركزي للأنبوب الفارغ لمدة دقيقتين ، فيمكن ترك عمود التنقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بعد الطرد المركزي للأنبوب الفارغ لإزالة الإيثانول المتبقي بالكامل.
تحلل جزيئات الحمض النووي الريبي المنقى
ترتبط جودة الحمض النووي الريبي المنقى بعوامل مثل تخزين العينات وتلوث الحمض النووي الريبي والتشغيل.
تحليل الأسباب الشائعة ：
1- عدم حفظ العينات التي تم جمعها في الوقت المناسب.
اقتراح: إذا لم يتم استخدام العينة في الوقت المناسب بعد الجمع ، فيرجى تخزينها عند -80 ℃ أو النيتروجين السائل على الفور.لاستخراج جزيئات الحمض النووي الريبي ، حاول استخدام العينات التي تم جمعها حديثًا كلما أمكن ذلك.
2- تم تجميد العينات التي تم جمعها وذوبانها بشكل متكرر.
اقتراح: تجنب التجميد والذوبان المتكرر (ليس أكثر من مرة) أثناء جمع العينة وتخزينها ، وإلا سينخفض إنتاج الحمض النووي.
3. تم إدخال RNase في غرفة العمليات أو لم يتم ارتداء القفازات والأقنعة التي تستخدم لمرة واحدة وما إلى ذلك.
اقتراح: من الأفضل إجراء تجربة استخراج جزيئات الحمض النووي الريبي في غرفة عمليات منفصلة للحمض النووي الريبي ، ويتم تنظيف الجدول التجريبي قبل التجربة.ارتداء القفازات والأقنعة التي تستخدم لمرة واحدة أثناء التجربة لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي الناجم عن إدخال RNase.
4- يتلوث الكاشف بـ RNase أثناء الاستخدام.
اقتراح: استبدل بـ Viral RNA Isolation Kit للتجارب ذات الصلة.
5. تلوث RNase لأنابيب الطرد المركزي ، ونصائح الماصة ، إلخ. اقتراح: تأكد من أن أنابيب أجهزة الطرد المركزي ، وأطراف الماصة ، والماصات خالية من RNase.
أثرت جزيئات الحمض النووي الريبي المنقى على تجارب المصب
ستؤثر جزيئات الحمض النووي الريبي المنقى بواسطة عمود التنقية على تجارب المصب إذا كان هناك الكثير من أيونات الملح أو البروتينات ، مثل: النسخ العكسي ، اللطخة الشمالية ، إلخ.
1. هناك أيونات ملح متبقية في جزيئات الحمض النووي الريبي المزال.
توصية: تأكد من إضافة الحجم الصحيح للإيثانول اللامائي إلى Buffer viRW2 ، واغسل عمود التنقية مرتين وفقًا لسرعة الطرد المركزي الصحيحة في تعليمات التشغيل ； إذا كان لا يزال هناك أيونات ملح متبقية ، يمكنك إضافة Buffer viRW2 إلى عمود التنقية ، وتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.ثم قم بإجراء الطرد المركزي لإزالة تلوث أيونات الملح إلى أقصى حد
2. هناك ما تبقى من الإيثانول في جزيئات الحمض النووي الريبي المزال
اقتراح: بمجرد التأكيد على أن أعمدة التنقية قد تم شطفها بواسطة Buffer viRW2 ، قم بإجراء الطرد المركزي للأنبوب الفارغ وفقًا لسرعة الطرد المركزي في تعليمات التشغيل.إذا كان لا يزال هناك إيثانول متبقي ، فيمكن تركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد طرد مركزي بأنبوب فارغ لإزالة الإيثانول المتبقي إلى أقصى حد.
كتيبات التعليمات:
دليل تعليمات طقم عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي
