1. الفهم الأولي

في هذه المرحلة ، نحتاج إلى فهم بعض المفاهيم والمصطلحات ، حتى نتجنب ارتكاب أخطاء أمام كبار السن لدينا ، مثل:

س: ما الفرق بين RT-PCR و qPCR و Real-time PCR و RT-PCR في الوقت الفعلي؟

الجواب: RT-PCR هو نسخ عكسي PCR(النسخ العكسي PCR ، RT-PCR) ، وهو متغير يستخدم على نطاق واسع لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).في RT-PCR ، يتم نسخ خيط RNA عكسيًا إلى DNA تكميلي ، والذي يستخدم بعد ذلك كقالب لتضخيم الحمض النووي بواسطة PCR.
الوقت الحقيقي- PCR و qPCR(Rea-ltime-PCR) هما نفس الشيء ، كلاهما عبارة عن PCR كمي في الوقت الفعلي ، مما يعني أن كل دورة من PCR لها سجلات بيانات في الوقت الفعلي ، وبالتالي يمكن تعديل عدد قوالب البدء بتحليل دقيق.

على الرغم من أن كل من PCR في الوقت الحقيقي (PCR الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي) والنسخ العكسي PCR (النسخ العكسي PCR) يبدو أنه يتم اختصارهما كـ RT-PCR ، فإن الاتفاقية الدولية هي: يشير RT-PCR تحديدًا إلى النسخ العكسييتم اختصار PCR ، في الوقت الحقيقي PCR بشكل عام كـ qPCR (الوقت الحقيقي الكمي PCR).

و RT-PCR (RT-qPCR) في الوقت الحقيقي ، إنه النسخ العكسي PCR جنبًا إلى جنب مع التكنولوجيا الكمية الفلورية: أولاً احصل على (كدنا) (RT) من النسخ العكسي للـ RNA ، ثم استخدم PCR في الوقت الحقيقي للتحليل الكمي (qPCR).تقوم معظم المختبرات بإجراء RT-qPCR ، أي البحث في التنظيم السفلي لتعبير RNA ، لذا فإن qPCR الذي يتحدث عنه الجميع في المختبر يشير في الواقع إلى RT-qPCR ، لكن لا تنس أنه لا يزال هناك العديد من اختبارات الحمض النووي في التطبيقات السريرية.التحليل الكمي ، مثل الكشف عن فيروس التهاب الكبد B HBV.

سؤال: بعد قراءة الكثير من PCR الكمي الفلوري ، لماذا يجب التحكم في الجزء المتضخم في نطاق 80-300bp؟

إجابة: يختلف طول كل تسلسل جيني ، فبعضها يصل إلى عدة كيلوبايت ، وبعضها مئات من نقاط الأساس ، لكننا نحتاج فقط إلى أن يكون طول المنتج 80-300 نقطة أساس عند تصميم البادئات ، فالقصر الشديد أو الطويل جدًا غير مناسب للكشف الكمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).جزء المنتج قصير جدًا بحيث لا يمكن تمييزه عن جهاز التمهيدي الثنائى.يبلغ طول الثنائى التمهيدي حوالي 30-40 نقطة أساس ، ويصعب التمييز بين كونه أولًا ثنائيًا أو منتجًا إذا كان أقل من 80 نقطة أساس.إذا كان جزء المنتج طويلاً للغاية ، ويتجاوز 300 نقطة أساس ، فسيؤدي ذلك بسهولة إلى كفاءة تضخيم منخفضة ولا يمكنه اكتشاف كمية الجين بشكل فعال.

على سبيل المثال ، عند حساب عدد الأشخاص في الفصل الدراسي ، ما عليك سوى حساب عدد الأفواه الموجودة.وينطبق الشيء نفسه عندما تكتشف الجينات ، فأنت تحتاج فقط إلى اكتشاف تسلسل معين من الجين لتمثيل التسلسل بأكمله.إذا كنت تريد عد الأشخاص ، فأنت بحاجة إلى عد الأفواه والأنوف والأذنين والنظارات ، ومن السهل ارتكاب الأخطاء.

للتوسع ، في البحث البيولوجي ، هناك العديد من الحالات البحثية من نقطة إلى أخرى ، نظرًا لأن التسلسل الجيني لأي نوع طويل جدًا ، فمن غير الضروري ومن المستحيل قياس جميع الشظايا ، مثل التسلسل البكتيري 16S ، وهو إجراء التسلسل المحافظ لفحوصات البكتيريا لاستنتاج عدد مجموعة معينة من البكتيريا.

س: ما هو الطول الأمثل لتصميم qPCR التمهيدي؟

إجابة: بشكل عام ، يبلغ طول التمهيدي حوالي 20-24 نقطة أساس ، وهو أفضل.بالطبع ، يجب الانتباه إلى قيمة TM للبرايمر عند تصميم التمهيدي ، لأن هذا مرتبط بدرجة حرارة التلدين المثلى.بعد الكثير من التجارب ، ثبت أن 60 درجة مئوية أفضل قيمة TM.إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا ، فسيؤدي ذلك بسهولة إلى تضخيم غير محدد.إذا كانت درجة حرارة التلدين عالية جدًا ، فستكون كفاءة التضخيم منخفضة نسبيًا ، وستبدأ ذروة منحنى التضخيم لاحقًا ، وستتأخر قيمة CT.

س: كيف تختلف طريقة الصبغ عن طريقة الفحص؟

الجواب: طريقة الصبغبعض الأصباغ الفلورية ، مثل SYBR Green Ⅰ ، و PicoGreen ، و BEBO ، وما إلى ذلك ، لا تصدر ضوءًا من تلقاء نفسها ، ولكنها تنبعث منها مضان بعد الارتباط بالأخدود الصغير للحمض النووي المزدوج الشريطة.لذلك ، في بداية تفاعل PCR ، لا يمكن للآلة اكتشاف إشارة الفلورسنت.عندما يصل التفاعل إلى مرحلة التمديد ، يتم فتح الخيط المزدوج ، ويتم تصنيع خيط جديد تحت تأثير بوليميريز الحمض النووي ، ويرتبط جزيء الفلورسنت بأخدود dsDNA الصغير.مع زيادة عدد دورات PCR ، يتم دمج المزيد والمزيد من الأصباغ مع الحمض النووي مزدوج الشريطة ، كما يتم أيضًا تحسين إشارة الفلورسنت باستمرار.تستخدم طريقة الصبغ بشكل رئيسي في البحث العلمي.
ملاحظة: كن حذرًا عند إجراء التجربة ، يجب دمج الصبغة مع الحمض النووي البشري ، احرص على تحويلها إلى شخص فلوري.

طريقة الصبغ (يسار) طريقة التحقيق (يمين)
ملاحظة: كن حذرًا عند إجراء التجربة ، يجب دمج الصبغة مع الحمض النووي البشري ، احرص على تحويلها إلى شخص فلوري.

SYBR Green يرتبط بالأخدود الصغير للحمض النووي

طريقة التحقيقمسبار Taqman هو أكثر مسبار التحلل المائي استخدامًا.توجد مجموعة فلورية في نهاية 5 للمسبار ، عادةً FAM ، والمسبار نفسه عبارة عن تسلسل مكمل للجين المستهدف.هناك مجموعة تبريد الفلورسنت في 3 نهاية.وفقًا لمبدأ نقل طاقة الرنين الفلوري (نقل طاقة الرنين Förster ، FRET) ، عندما يتم تحفيز مجموعة التألق المراسل (جزيء الفلورسنت المتبرع) ومجموعة الفلورسنت الإخماد (جزيء الفلورسنت المتقبل) عندما يتداخل الأطياف والمسافة قريبة جدًا (7-10 نانومتر) ، يمكن أن تحفز إثارة جزيء المانح التألق الذاتي.لذلك ، في بداية تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، عندما يكون المسبار مجانيًا وسليمًا في النظام ، لن تصدر مجموعة الفلورسنت المراسل أي مضان.عند التلدين ، يلتزم التمهيدي والمسبار بالقالب.أثناء مرحلة التمديد ، يصنع البوليميراز سلاسل جديدة باستمرار.يحتوي بوليميريز الحمض النووي على نشاط نوكلياز خارجي 5′-3.عند الوصول إلى المسبار ، سوف يتحلل بوليميراز الحمض النووي المسبار من القالب ، ويفصل مجموعة الفلورسنت المراسل عن مجموعة الفلورسنت المخمدة ، ويطلق إشارة الفلورسنت.نظرًا لوجود علاقة رأس برأس بين المجس والقالب ، فإن طريقة المسبار تتفوق على طريقة الصبغة من حيث دقة الاختبار وحساسيته.تستخدم طريقة المسبار بشكل رئيسي في التشخيص.

س: ما هو القياس الكمي المطلق؟ما هو القياس النسبي؟

إجابة: يشير التقدير الكمي المطلق إلى حساب رقم النسخة الأولية للعينة التي سيتم اختبارها بواسطة qPCR ، مثل عدد فيروسات HBV الموجودة في 1 مل من الدم.النتيجة التي تم الحصول عليها عن طريق القياس الكمي النسبي هي التغيير في كمية الجين المستهدف في عينة محددة بالنسبة لعينة مرجعية أخرى ، ويتم تنظيم التعبير الجيني أو تقليله.

س: هل ستؤثر كمية استخراج الحمض النووي الريبي وكفاءة النسخ العكسي وكفاءة التضخيم على النتائج التجريبية؟
س: هل سيؤثر تخزين العينات ، وكواشف الاستخراج ، وكواشف النسخ العكسي ، والمواد الاستهلاكية التي تنقل الضوء على النتائج التجريبية؟
س: ما هي الطريقة التي يمكنها تصحيح البيانات التجريبية؟

فيما يتعلق بهذه المشكلات ، سنصفها بالتفصيل في الأقسام المتقدمة والمتقدمة أدناه.
2. المعرفة المتقدمة

فيما يتعلق بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي ، يجب أن ندرك حقيقة أن آلاف الأوراق البحثية العلمية تُنشر كل عام ، من بينها تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري ليس عددًا صغيرًا.

إذا لم يكن هناك معيار مشترك لقياس تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري ، فقد تختلف النتائج على نطاق واسع.بالنسبة لنفس الجين من نفس النوع ، وبنفس طريقة المعالجة ، ستختلف نتائج الكشف أيضًا على نطاق واسع ، وسيكون من الصعب على المتأخرين تكرار نفس النتائج.لا أحد يعرف ما هو الصواب وما هو الخطأ.

هل هذا يعني أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري هو تقنية غش أو تقنية غير موثوقة؟لا ، ذلك لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري أكثر حساسية وأكثر دقة ، وستؤدي العملية الخاطئة إلى نتائج معاكسة تمامًا.خسارة صغيرة تبعد ألف ميل.كاتب المقال قد يتعرض للتعذيب بشكل متكرر من قبل المراجعين.في الوقت نفسه ، يصعب أيضًا اختيار المراجعين للمجلة من بين النتائج التجريبية المختلفة.

بشكل عام ، يشير إلى عدم وجود توافق في الآراء في تجارب PCR في الوقت الحقيقي.تحقيقا لهذه الغاية ، بدأ كبار العلماء في الصناعة في صياغة المعايير ،مطالبة المساهمين بتوفير بعض التفاصيل التجريبية ومعالجة البيانات الضرورية (بما في ذلك البيانات الضرورية) في المقالة للوفاء بهذه المعايير.

يمكن للمراجعين الحكم على جودة التجربة من خلال قراءة هذه التفاصيل ؛يمكن للقراء في المستقبل أيضًا استخدام هذا لتكرار التجربة أو تحسين التجربة.ثم تكون النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة مليئة بالمعلومات وذات جودة عالية وقابلة للاستخدام.

MIBBI (الحد الأدنى من المعلومات للتحقيقات البيولوجية والطبية الحيوية -http: // www.mibbi.org) خرجت الى حيز الوجود.MIBBI هو مشروع يوفر معايير للتجارب.يتم نشره في الطبيعة.يهدف هذا المشروع إلى تجارب بيولوجية مختلفة ، بما في ذلك بيولوجيا الخلية ، ميكروأري ، qPCR التي سنناقشها الآن ، وما إلى ذلك ، ويوفر لكل نوع من التجارب عند تقديم المخطوطات.يجب توفير هذه المعلومات في جميع الأوقات.

في مشروع MIBBI ، هناك مقالتان تتعلقان بـ PCR الكمي الفلوري ، وهما:
· RDML (لغة ترميز بيانات PCR في الوقت الحقيقي) - لغة منظمة ودليل إعداد التقارير لبيانات PCR الكمية في الوقت الحقيقي ؛
· MIQE (الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب PCR الكمية في الوقت الحقيقي) - الحد الأدنى من المعلومات لنشر مقالات حول تجارب PCR الكمية في الوقت الحقيقي.
أولاً ، دعنا نتحدث عن RDML ، مواصفات المصطلحات.

إذا لم يكن هناك تعريف موحد لكل شيء ، فمن المستحيل مواصلة المناقشة ، وهذا هو سبب أهمية شرح المصطلحات في الامتحان.
تتضمن المصطلحات المستخدمة في تجربة PCR الكمية الفلورية المحتوى التالي.لقد قدمت QIAGEN أفضل ملخص لنا.ما يلي كلها جافةبضائع .

منحنى التضخيم
يشير منحنى التضخيم إلى المنحنى الذي تم إجراؤه أثناء عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع رقم الدورة على أنه الإحداثي وشدة التألق في الوقت الفعلي أثناء التفاعل على أنها تنسيق.

يجب أن يكون لمنحنى التضخيم الممتاز الخصائص التالية: خط الأساس مسطح أو منخفض قليلاً ، ولا يوجد اتجاه تصاعدي واضح ؛نقطة انعطاف المنحنى واضحة ، وانحدار المرحلة الأسية يتناسب مع كفاءة التضخيم.كلما زاد المنحدر ، زادت كفاءة التضخيم ؛منحنى التضخيم الكلي التوازي جيد ، مما يشير إلى أن كفاءة التضخيم لكل أنبوب متشابهة ؛المرحلة الأسية لمنحنى التضخيم لعينات التركيز المنخفض واضحة.

خط الأساس (خط الأساس)
خط الأساس هو مستوى الضوضاء للدورة المبكرة، يتم قياسها عادة بين الدورة الثالثة والخامسة عشرة ، لأنه لا يمكن اكتشاف زيادة قيمة الفلورة الناتجة عن منتج التضخيم خلال هذه الفترة.يمكن أن يتنوع عدد الدورات المستخدمة لحساب خط الأساس وقد تحتاج إلى تقليلها إذا تم استخدام كميات كبيرة من القالب أو إذا كان مستوى التعبير للجين المستهدف مرتفعًا.

يتطلب إعداد خط الأساس عرض بيانات التألق من منحنى التضخيم الخطي.يتم تعيين خط الأساس بحيث يبدأ نمو منحنى التضخيم برقم دورة أكبر من الرقم العلوي لدورة خط الأساس.يجب تعيين خطوط الأساس بشكل فردي لكل تسلسل مستهدف.يجب طرح متوسط ​​قيم التألق المكتشفة في الدورات المبكرة من قيم التألق التي تم الحصول عليها في المنتجات المضخمة.تسمح أحدث الإصدارات من برامج Real-Time PCR المختلفة بالتحسين التلقائي للإعدادات الأساسية للعينات الفردية.

خلال الدورات القليلة الأولى من تفاعل تضخيم PCR ، لا تتغير إشارة التألق كثيرًا.الاقتراب من خط مستقيم يسمى الخط الأساسي ، ولكن إذا نظرنا عن كثب إلى الدورات القليلة الأولى ، فإننا نرى أنه داخل خط الأساس هو ما يحدث في الصورة أدناه.

الخلفية تشير إلى الخلفية
قيمة التألق غير المحددة في التفاعل.على سبيل المثال: التبريد غير الفعال الفلوري ؛أو عدد كبير من قوالب الحمض النووي مزدوجة الشريطة بسبب استخدام SYBR Green.تتم إزالة مكونات الخلفية للإشارة رياضياً بواسطة خوارزمية برنامج Real-Time PCR.

إشارة المراسل
تشير إشارة المراسل إلى إشارة الفلورسنت التي تم إنشاؤها بواسطة SYBR Green أو تحقيقات خاصة بالتسلسل المسمى fluorescently أثناء Real-Time PCR.

إشارة مراسل طبيعية (RN)
يشير RN إلى كثافة التألق لصبغة المراسل مقسومة على كثافة التألق للصبغة المرجعية السلبية المقاسة في كل دورة.

صبغة مرجعية سلبية
في بعض تقارير PCR في الوقت الفعلي ،يتم استخدام صبغة الفلورسنت ROX كمرجع داخلي لتطبيع إشارة الفلورسنت.وهو يصحح الاختلافات بسبب عدم دقة الماصات ، وموضع البئر ، وتقلبات التألق على أساس كل بئر.

عتبة التألق (العتبة)
أعلى من قيمة الخلفية وأقل بكثير من قيمة الهضبة لمنحنى التضخيم.يجب أن تقع في المنطقة الخطية لمنحنى التضخيم ، والتي تمثل النطاق اللوغاريتمي الخطي لاكتشاف PCR.يجب تعيين العتبات في عرض منحنى تضخيم السجل بحيث يمكن التعرف بسهولة على المرحلة اللوغاريتمية الخطية لـ PCR.إذا كانت هناك جينات مستهدفة متعددة في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ، فيجب تعيين الحد الأدنى لكل هدف.بشكل عام ، يتم استخدام إشارة التألق لأول 15 دورة من تفاعل PCR كإشارة خلفية مضان ، وعتبة التألق هي 10 أضعاف الانحراف المعياري لإشارة التألق لأول 3 إلى 15 دورة من PCR ، ويتم تعيين عتبة التألق في المرحلة الأسية لتضخيم PCR.بشكل عام ، كل أداة لها عتبة مضان محددة قبل الاستخدام.

عتبة الدورة (CT) أو نقطة العبور (CP)
الدورة التي يتجاوز عندها منحنى التضخيم العتبة (أي النقطة التي يزداد عندها اكتشاف التألق بشكل كبير).يمكن أن يكون CT جزءًا صغيرًا ويمكن حساب مقدار قالب البداية.تمثل قيمة CT عدد الدورات التي تمت تجربتها عندما تصل إشارة الفلورسنت في كل أنبوب تفاعل PCR إلى الحد المحدد.توجد علاقة خطية بين قيمة CT لكل قالب ولوغاريتم رقم النسخة الأولية للقالب ،أعلى رقم النسخة الأولية ، وقيمة CT أصغر ، والعكس صحيح.يمكن عمل منحنى قياسي باستخدام معيار برقم نسخة أولية معروفة ، حيث يمثل الإحداثي قيمة CT ، ويمثل الإحداثي لوغاريتم رقم النسخة الأولية.لذلك ، طالما تم الحصول على قيمة CT للعينة غير المعروفة ، يمكن حساب رقم النسخة الأولية للعينة من المنحنى القياسي.

قيمة ΔCT
تصف قيمة ΔCTالفرق بين الجين المستهدف وقيمة التصوير المقطعي المحوسب للجين المرجعي الداخلي، مثل جين التدبير المنزلي ، ويستخدم لتطبيع كمية القالب المستخدم:
⇒ΔCT = CT (الجين المستهدف) - CT (الجين المرجعي الداخلي)

قيمة ΔΔCT
تصف قيمة ΔΔCT الفرق بين متوسط ​​قيمة ΔΔCT لعينة مثيرة للاهتمام (على سبيل المثال ، الخلايا المحفزة) وقيمة ΔΔCT المتوسطة لعينة مرجعية (على سبيل المثال ، الخلايا غير المحفزة).تسمى العينة المرجعية أيضًا عينة المعايرة ويتم تطبيع جميع العينات الأخرى لهذا القياس الكمي النسبي:
⇒ΔΔCT = متوسط ​​ΔCT (عينة من الاهتمام) - متوسط ​​ΔCT (عينة مرجعية)

جينات مرجعية داخلية (جينات مرجعية داخلية)
لا تختلف مستويات التعبير عن الجينات المرجعية الداخلية ، مثل جينات التدبير المنزلي (جينات التدبير المنزلي) ، بين العينات.تسمح مقارنة قيم CT للجين المرجعي بالجين المستهدف بتطبيع مستوى التعبير للجين المستهدف مع كمية إدخال RNA أو cDNA (انظر القسم الخاص بقيم ΔCT أعلاه).

الجينات المرجعية الداخلية الصحيحة لاحتمال تدهور الحمض النووي الريبي أو وجود مثبطات الإنزيم في عينات الحمض النووي الريبي ، وكذلك الاختلافات في محتوى الحمض النووي الريبي ، وكفاءة النسخ العكسي ، واستعادة الحمض النووي ، ومعالجة العينات.لتحديد الجينات المرجعية المثلى ، قمنا بتعديل الخوارزمية للسماح باختيارها للمرجع الأمثل الذي يعتمد على الإعداد التجريبي.

تحكم داخلي
تسلسل تحكم يتم تضخيمه في نفس تفاعل التسلسل المستهدف ويتم فحصه باستخدام مسبار مختلف (أي إجراء PCR مزدوج).غالبًا ما تُستخدم الضوابط الداخلية لاستبعاد عمليات التضخيم الفاشلة ، مثل عدم اكتشاف التسلسل الهدف.
عينة المعايرة
عينة مرجعية (على سبيل المثال ، الحمض النووي الريبي المنقى من خط الخلية أو الأنسجة) المستخدمة في القياس الكمي النسبي لمقارنة جميع العينات الأخرى لتحديد مستوى التعبير النسبي للجين.يمكن أن تكون عينة المعايرة أي عينة ، ولكنها عادة ما تكون عنصر تحكم (على سبيل المثال ، عينة غير معالجة أو عينة من الوقت صفر للتجربة).

الضوابط الإيجابية
استخدام تفاعلات التحكم معكميات معروفة من القالب.غالبًا ما تستخدم عناصر التحكم الإيجابية للتحقق من أن مجموعة التمهيدي أو مجموعة المسبار التمهيدي تعمل بشكل صحيح وأن التفاعل تم إعداده بشكل صحيح.

لا يوجد تحكم قالب (NTC)
تفاعل تحكم يحتوي على جميع المكونات الضرورية لتفاعل التضخيم باستثناء القالب الذي يتم استبداله عادةً بالماء.يمكن أن يكشف استخدام NTC عن التلوث الناجم عن تلوث الكاشف أو الحمض النووي الغريب ، وبالتالي ضمان مصداقية وموثوقية بيانات الكشف.تضخيم تحكم NTC يشير إلى وجود تلوث.

لا يوجد تحكم RT (NRT)
قد تحتوي عملية استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) على الحمض النووي الجيني المتبقي ، والذي يعد ضارًا للغاية وهو الجاني الذي يؤثر على جودة البيانات والعدو الطبيعي لـ qPCR ، لذلك عند تصميم التجارب ، يجب تصميمه لتضخيم اكتشاف الحمض النووي الريبي فقط.هناك طريقتان ، الأولى هي تصميم الاشعال عبر الإنترونات ، والأخرى هي إزالة الحمض النووي تمامًا ، أيهما أفضل ، والتي ستتم مناقشتها لاحقًا.جهاز التحكم NTR هو مرآة سحرية لاكتشاف تلوث الحمض النووي.إذا كان هناك تضخيم ، فهذا يعني وجود تلوث.

المعايير
المعايير هي عينات من التركيز المعروف أو رقم النسخ الذي يتم استخدامه لبناء منحنى قياسي.من أجل ضمان استقرار المعيار ، عادة ما يتم استنساخ جزء الجين في البلازميد واستخدامه كمعيار.

المنحنى القياسي
عادةً ما يتم تخفيفه إلى 5 تدرجات تركيز على الأقل مع المنتج القياسي وفقًا لنسبة المضاعفة ، ويتم رسم 5 نقاط في إحداثيات قيمة CT ورقم النسخ ، ويتم توصيل النقاط لتشكيل خط لإنشاء منحنى قياسي.لكل منحنى قياسي ، يجب التحقق من صحته.تنخفض قيمة المنحدر بين -3.3 و -3.8 ، ويتم تنفيذ كل تركيز في ثلاث نسخ.يجب تجاهل النقاط التي تختلف اختلافًا كبيرًا عن النقاط الأخرى.يتم إدخال قيمة CT للعينة المراد اختبارها في المنحنى القياسي ، ويمكن حساب مستوى التعبير للعينة المراد اختبارها.

يتم إدخال قيمة CT للعينة المراد اختبارها في المنحنى القياسي ، ويمكن حساب رقم النسخة الأولية للعينة المراد اختبارها.

الكفاءة والانحدار
يمثل منحدر المنحنى القياسي كفاءة PCR في الوقت الفعلي.
· يشير المنحدر البالغ -3.322 إلى أن كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل هي 1 ، أو 100٪ فعالة ، وأن كمية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل تتضاعف في كل دورة.
· يشير منحدر أقل من -3.322 (على سبيل المثال ، -3.8) إلى كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل
· يشير ميل أكبر من -3.322 (على سبيل المثال ، -3.0) إلى أن كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل تبدو أكبر من 100٪ ، وهو أمر مثير للفضول ، كيف يمكن لدورة واحدة من تفاعل البوليميراز المتسلسل أن تولد أكثر من ضعف المنتج المضخم؟يحدث هذا الموقف في المرحلة غير الخطية من تفاعل PCR ، أي أن هناك قدرًا كبيرًا من التضخيم غير المحدد.

منحنى الانصهار
بعد اكتمال تضخيم qPCR ، يتم تسخين منتج PCR.مع ارتفاع درجة الحرارة ، يذوب منتج التضخيم مزدوج الشريطة تدريجيًا ، مما يؤدي إلى انخفاض في كثافة التألق.عندما يتم الوصول إلى درجة حرارة معينة (Tm) ، سوف يذوب عدد كبير من المنتجات.الإسفار ينخفض ​​بشكل حاد.تحتوي منتجات PCR المختلفة على قيم Tm مختلفة ودرجات حرارة انصهار مختلفة ، بحيث يمكن تحديد خصوصية PCR.

منحنى الانصهار (منحنى مشتق)
يتم اشتقاق منحنى الذوبان لتشكيل خريطة ذروة ، والتي يمكن أن تعرض بشكل حدسي حالة أجزاء منتج PCR.نظرًا لأن درجة حرارة الانصهار هي قيمة Tm لجزء الحمض النووي ، يمكن الحكم على بعض المعلمات التي تؤثر على قيمة Tm لجزء الحمض النووي ، مثل حجم الجزء ، ومحتوى GC ، وما إلى ذلك بشكل عام ، وفقًا لمبادئ التصميم التمهيدي لدينا ،يتراوح طول المنتج المضخم بين 80-300 نقطة أساس ، لذلك يجب أن تكون درجة حرارة الانصهار بين 80 درجة مئوية و 90 درجة مئوية.

تفسير منحنى الذوبان: إذا ظهرت الذروة الرئيسية الوحيدة بين 80 ° C-90 ° C ، فهذا يعني أن PCR الكمي الفلوري مثالي ؛إذا ظهرت الذروة الرئيسية بين 80 درجة مئوية - 90 درجة مئوية وتظهر قمم متنوعة أقل من 80 درجة مئوية ، فيتم اعتبار ثنائي التمهيدي بشكل أساسي.يمكنك محاولة زيادة درجة حرارة التلدين لحلها ؛إذا ظهرت الذروة الرئيسية بين 80 درجة مئوية و 90 درجة مئوية ، وظهرت الذروة المتنوعة مرة أخرى عندما ترتفع درجة الحرارة ، فيُعتبر أساسًا أن هناك تلوثًا بالحمض النووي ، ويجب إزالة الحمض النووي في المرحلة الأولية من التجربة.

بالطبع ، لا تزال هناك بعض المواقف غير الطبيعية ، والتي سيتم تقسيمها واحدة تلو الأخرى أدناه.
3. المعرفة المتقدمة

للقيام بـ qPCR ، يجب أن أقول MIQE ،الحد الأدنى من المعلوماتللنشركميالوقت الحقيقي PCRالتجارب - الحد الأدنى من المعلومات لنشر المقالات حول PCR الكمي في الوقت الحقيقيالتجارب.من أجل تبسيط فهم الجميع ، سنقوم بتبسيط المحتوى الرئيسي.

يمكنك البحث عن نص MIQE الأصلي على الإنترنت ، والأهم أنه ينص على أنقائمة مراجعة البيانات التي يجب توفيرها عند نشر مقال .

يمكن للمراجعين الحكم على جودة التجربة من خلال قراءة هذه التفاصيل ؛يمكن للقراء في المستقبل أيضًا استخدام هذا لتكرار التجربة أو تحسينها.
تجدر الإشارة إلى أنه في هذه القائمة ، يتم تمييز أهمية كل قائمة بـ E أو D على التوالي.ماذا يعني ذلك؟هـ: المعلومات الأساسية (يجب تقديمها) ؛د: معلومات مرغوبة (قدم أكبر قدر ممكن).

MIQE (1) - تصميم تجريبي
لن يعرف العديد من المتخلفين الذين أكملوا دفاعهم بعد الانتهاء من دراساتهم العليا كيفية تصميم تجربة بشكل مستقل ، وفتح دفاترهم ، والقيام بما يطلبه المعلم منهم.ونتيجة لذلك ، لم يكن التصميم التجريبي صارمًا ، وقال قسم التحرير بالمجلة إنهم أرادوا تكوين هذه الصورة وتلك الصورة ، ففعلوا ذلك في حالة ذهول.هذه هي الطريقة التي يتم بها صنع scumbags!

أقرب إلى المنزل ، فإن المبدأ الأول للتجربة هو التحديدصرامة المنطق التجريبي.أهم شيء هو التصميم التجريبي ، وأهم ما في التصميم التجريبي هو كيفية تعيين العينة المستهدفة ، والعينة المرجعية (الضابطة) ، وعدد التكرارات ، بحيث يمكن الرجوع إلى البيانات التجريبية وقابلة للمقارنة والإقناع.

العينة المستهدفةيشير إلى العينة التي تتطلب منا الكشف عن الجين المستهدف بعد علاج معين.العينة المرجعيةهي العينة دون أي علاج ، والتي غالبًا ما يشار إليها بالنوع البري في علم الأحياء.

مكررات التجريبيةهي مهمة جدا.بشكل عام ، يجب أن يكون عدد التكرارات المقنعة أكثر من ثلاثة.من الضروري التمييز بين ما هو التكاثر البيولوجي وما هو التكرار التقني.

النسخ المتماثلة البيولوجية: تم إجراء نفس تجربة التحقق باستخدام مواد مختلفة (الوقت ، النباتات ، الدُفعات ، ألواح التفاعل).

الازدواجية البيولوجية
لنأخذ معاملة الفلفل بالمبيدات كمثال.نريد رش مبيدات الآفات على النباتات الثلاثة في ABC ، ​​ثم النباتات الثلاثة لـ ABC هي ثلاث مكررات بيولوجية ، وهي نفس تجربة التحقق التي تم إجراؤها باستخدام مواد مختلفة.ولكن كتجربة ، هناك حاجة بالتأكيد إلى عنصر تحكم ، حتى نتمكن من رش أحد فروع النبات A لتشكيل مجموعة تجريبية من النبات A ، وليس رش الفروع الأخرى للنبات A لتشكيل مجموعة ضابطة.افعل الشيء نفسه بالنسبة لـ B و C.

النسخ المتماثل الفنية (النسخ المتماثلة التقنية): هي تجربة متكررة مصممة لتجنب الأخطاء التي تسببها العملية ، والتي هي في الواقع ثقب مكرر متضمن في نفس المادة.يجب أن يكون لكل من العلاجات والضوابط إعدادات تكرار (ثلاثة على الأقل) للجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي.

التكرار الفني
خذ الفلفل المعالج بالمبيدات كمثال مرة أخرى.بالنسبة للمجموعة التجريبية من النبات A ، قمنا بعمل ثلاثة ثقوب PCR من 1 و 2 و 3 للجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي على التوالي ، وذلك لأخذ المتوسط ​​بعد الاكتشاف.للتحكم في النبات أ ، يتم التعامل مع المجموعات بنفس الطريقة.وبالمثل ، افعل نفس العلاج للنباتات B و C.هذا هو التكرار الفني.

من الجدير بالذكر أنما يدخل الإحصاء هو التكرار البيولوجي ، والتكرار التقني هو اختبار ما إذا كانت هناك أي ظواهر عشوائية في العملية التجريبية ، وذلك لجعل النتائج التجريبية ذات مصداقية ، أي لتجنب الأخطاء بأخذ متوسطها كما نقول في كثير من الأحيان.

الضوابط السلبية — NTC و NRT
NTC (تحكم بدون قالب)، عنصر تحكم بدون قالب ، يتم استخدامه للتحقق مما إذا كانت المواد التجريبية ملوثة.بشكل عام ، يتم استخدام الماء كقالب.إذا كان هناك تفاعل فلوري ، فهذا يشير إلى حدوث تلوث بالحمض النووي في المختبر.

تأتي هذه الملوثات من: المياه غير النقية ، والكواشف غير المؤهلة التي تحتوي على الحمض النووي الداخلي ، والتلوث التمهيدي ، وتلوث معدات المختبرات ، وتلوث الهباء الجوي ، وما إلى ذلك ، تحتاج إلى استخدام كاسحات RNase ومثبطات RNase.يعد تلوث الهباء الجوي هو الأصعب في العثور عليه.تخيل أن مختبرك مثل الضباب الدخاني ، مع وجود العديد من الأحماض النووية المعلقة في الهواء.

NRT (لا النسخ العكسي)، التحكم بدون النسخ العكسي ، هو الحمض النووي الريبي المنسوخ غير العكسي كعنصر تحكم سلبي ، وهو التحكم في بقايا جدنا.

عند القيام بالتعبير الجيني ، يتم الكشف عن كمية الحمض النووي الريبي عن طريق الكشف عن كمية (كدنا) بعد النسخ العكسي.إذا كان هناك بقايا جدنا عند تنقية الحمض النووي الريبي ، فسوف يتسبب ذلك في حدوث أخطاء في النتائج التجريبية ، لأن النتائج الفعلية التي تم الحصول عليها هي جدنا و كدنا.على المستوى الكلي ، وليس فقط [كدنا] ، يحتاج جدنا إلى إزالته بالكامل أثناء استخراج الحمض النووي الريبي.

MIQE (2) - معلومات عينة
يعني ما يسمى بالمعلومات النموذجية أنه عندما ننشر مقالًا حول qPCR ، يجب أن نشرح معلومات العينة بوضوح ، وهو جزء لا غنى عنه من المقالة.وبالمثل ، عندما نقوم بمعالجة العينات ، يجب علينا أيضًا تنظيم عملياتنا لضمان صحة العينات.

وصف العينة ما هو إلا نتيجة ، ويجب أن نولي مزيدًا من الاهتمام للمواد المأخوذة خلال التجربة بأكملها.

اختيار المواد التجريبية
عينات الدم - اختر دمًا جديدًا لمدة لا تزيد عن 4 ساعات.عينات الخلايا - اختر جمع الخلايا الجديدة في فترة نمو قوي.أنسجة حيوانية - اختر نسيجًا طازجًا ينمو بقوة.الأنسجة النباتية - اختر أنسجة جديدة وشابة.

لا بد أنك لاحظت أن هناك كلمة أساسية في هذه الجمل القليلة: جديدة.
بالنسبة للعينات المذكورة أعلاه ، فإن أفضل مجموعة فعالة من حيث التكلفة ومستقرة في السوق هي مجموعة Foregene ، والتي يمكنها استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي الخاصين بها بسرعة وسهولة.

مجموعة صغيرة من DNA الدم

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للخلايا

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للحيوان

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للنبات

طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي للنباتات زائد

طقم عزل الحمض النووي للنبات

تخزين المواد التجريبية
بشكل عام ، لا نوصي بتخزين العينات ، إذا سمحت الظروف بذلك.ومع ذلك ، هناك العديد من الأصدقاء الذين لا يستطيعون إجراء التجارب فورًا بعد أخذ العينات ، ويحتاج البعض حتى إلى حمل خزانات النيتروجين السائل إلى الميدان لأخذ العينات.

بالنسبة لهذا النوع من الأصدقاء الذين يعملون بجد ، لا يسعني إلا أن أقول إنك لا تفهم المواد الاستهلاكية في الكاشف.تنتج العديد من شركات الكاشف المستهلك الآن كواشف يمكنها تخزين عينات الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة ، ويمكنك اختيار استخدامها.طريقة التخزين التقليدية هي تخزين النيتروجين السائل ، باستخدام خزان نيتروجين سائل صغير يسهل حمله.بعد إحضار العينة إلى المختبر ، قم بتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية.

بالنسبة للتجارب التي تتضمن RNA ، يجب اتباع مبدأ الكلمات الست:درجة حرارة منخفضة ، لا إنزيمات ،وسريع .

مفهوم درجة الحرارة المنخفضة سهل الفهم ؛بدون الإنزيمات ، RNase موجود في كل مكان في العالم الذي نعيش فيه (وإلا كنت ستقتل بواسطة فيروس نقص المناعة البشرية) ، لذا فإن كيفية تجنب RNase عند إجراء التجارب هو مفهوم مهم للغاية ؛سريع،لا يوجد كونغ فو في العالم لا يمكن كسره ، فقط السرعة لا يمكن كسرها.

لذلك ، بمعنى ما ، كلما كان وقت الاستخراج أقصر ، كانت المجموعة أفضل.لماذا يفعلفورجينتؤكد مجموعة أدوات السرعة على السرعة ، لأنهم يعرفون ذلك جيدًا.

ملاحظة: تقوم بعض الفتيات بإجراء التجارب بحذر شديد ، لكنهن لا يتمتعن بجودة البطولات الاربع بعد عدة سنوات من العمل.إنهم يشعرون أن الله غير عادل ، ويشتكون على الآخرين ، ويبحثون عن الحياة.في الواقع ، لم تفهم ذلك.لم يحمي الجيش الملكي النيبالي جيدًا ، وكان لاعب البطولات الاربع ذكيًا.عندما كان يقوم بالتجربة ، اعتقد أنه سينهي الضربة القاضية بثلاث مرات وخمس مرات وقسمتين ، لكنه أجرى التجربة بشكل جيد.

ملحوظة: أبطأ ، فرص أكبر لغزو RNase.كيف تدرب نفسك على أن تكون سريعًا؟لا توجد طريقة ، فقط تدرب أكثر.

بالنسبة للتجارب المختلفة والعينات المختلفة ، لا يزال من الضروري قراءة المزيد من الأدبيات واختيار طريقة مناسبة للمعالجة.بالنسبة لعملية جمع العينات وتخزينها ، تتطلب MIQE أنه يجب كتابتها بوضوح في الورقة ، حتى يتمكن المراجعون من مراجعة موثوقية الورقة ، كما أنه من الملائم أيضًا أن يكرر الصغار المذهولون تجربتك.

على الرغم من صعوبة التجارب البيولوجية ، إلا أنها متطورة.إذا لم تكن حريصًا ، يمكنك قلب العالم.على سبيل المثال ، تحويل مرض السارس إلى أزمة كيميائية حيوية ، أو صنع أرز هجين لإنقاذ 1.3 مليار شخص.الصورة أدناه عبارة عن تجربة كيميائية ، يجب أن تفهم مدى فخرك ببحثك فقط من خلال النظر إلى مظهره الذي يشبه القضيب.ننسى ذلك ، لا الأسود له.

MIQE (3) - استخراج الحمض النووي.
يعد استخراج الحمض النووي حدثًا كبيرًا ، وتبدأ جميع تجارب البيولوجيا الجزيئية باستخراج الحمض النووي.بادئ ذي بدء ، دعنا ننسخ محتوى MIQE على استخراج الحمض النووي.

بالنظر إلى هذا النموذج ، لا يمكنك البقاء على السطح.الشكل هو عقيدة.لكي تكون طالبًا متفوقًا ، يجب أن تسأل لماذا.المحتوى الأساسي لهذا الجدول هو: متابعةنقاء وسلامة واتساق واستخراج كمية من الحمض النووي الريبي .

الجزء الأول منالعملية أو الأداة هي خطوة استخراج الحمض النووي.إذا كنت تستخدم مستخرجًا آليًا للحمض النووي للاستخراج (متقدم ، يرجى الاتصال بي للشراء) ، فأنت بحاجة إلى الإشارة إلى اسم طراز الجهاز.

اسم العدة و

ما هي المجموعة التي تم استخدامها لتفاصيل التغيير ، وما هي الكواشف الخاصة التي تمت إضافتها أو العمليات الخاصة التي تم إجراؤها ، يجب شرحها بوضوح حتى يتمكن الآخرون من تكرار تجربتك بسهولة.

يضيف بعض الأشخاص بعض الكواشف الخاصة عند استخراج عينات خاصة ، معتقدين أن هذا هو سلاحهم السري ولا يخبرون الآخرين.مع الحفاظ على سريتها ، يفقدون أيضًا فرصة جعل مقالتك تتألق.لا تكن ذكيًا ، عليك أن تكون أكثر صدقًا من البلد القديم تشانغ في البحث العلمي ، إذا كنت تريد أن تكون ذكيًا ، فإن المقالة ستجعلك غبيًا.

يجب أن تتذكر رقم منتج المجموعةعند طلب المجموعة وكتابة المقال.يوجد بشكل عام رقمان على المجموعة: رقم الكتالوج Cat (رقم المنتج ، رقم المقالة) ، اللوت - رقم دفعة المنتج (يُستخدم للإشارة إلى الدُفعة التي جاء منها المنتج).

بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما يتم استخدام رقم CAS عند طلب الكواشف الكيميائية الحيوية ، وسأقوم بتعميمه معًا.رقم CAS هو الرقم الذي قدمته الجمعية الكيميائية الأمريكية لكل دواء كيميائي جديد.بشكل عام ، ترتبط ثلاثة أرقام بشرطة.رقم Rushui's CAS: 7732-18-5.غالبًا ما تحتوي المواد الكيميائية على أسماء مستعارة متعددة ، لكن رقم CAS فريد.عند طلب الدواء ، يمكنك التحقق من رقم CAS الخاص به أولاً.

بالقرب من المنزل ، لماذا يتعين علينا وصف هذه الأشياء بوضوح؟في الواقع ، من الضروري أيضًا التحقق من جودة استخراج الحمض النووي الريبي.سيؤدي استخدام الأدوات والمجموعات إلى جعل استخراج الحمض النووي الريبي أكثر اتساقًا.حجم الاستخراج للمختبرات العادية ليس كبيرًا ، ويمكن الحصول عليه باستخدام مجموعات.

تفاصيل علاج DNase أو RNase
إن القضية المهمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري هي منع تلوث الحمض النووي ، ولا تجرب إذا كان هناك تلوث.لذلك ، من الضروري ذكر العملية التي استخدمتها لمعالجة الحمض النووي ، من أجل إثبات أن الحمض النووي في العملية التجريبية قد تمت إزالته بالكامل وبشكل كامل.ممثلة برسم تخطيطي.

رسم تخطيطي للحمض النووي الريبي والحمض النووي
بشكل عام ، طريقة إزالة الحمض النووي هي معالجة RNA بـ DNase بعد الاستخراج.ومع ذلك ، فهذه طرق قديمة نسبيًا.تمكنت مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التجارية من إزالة الحمض النووي أثناء عملية الاستخراج دون إضافة DNase.على سبيل المثال ، سلسلة مجموعات من Foregene.

ملحوظة: إن إزالة الحمض النووي أثناء استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) هو سيف ذو حدين خطير للغاية ، والذي سيطيل من وقت عملية استخراج الحمض النووي الريبي ويزيد من خطر تدهور الحمض النووي الريبي.في الأساس ، إنها مقايضة بين عائد الحمض النووي الريبي والنقاء.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن كمية DNase المضافة إلى عمود الامتصاص القائم على السيليكا صغيرة جدًا ، ويجب استخدام DNase عالي الجودة لتحقيق التأثير.لا يمكن هضم DNase غير المحسن بسرعة وبشكل كامل.هذا اختبار للمستوى الفني للتاجر.بالطبع ، هناك المزيد من التجار الأكثر غرابة الذين يتباهون بإمكانية إزالة الحمض النووي بدون DNase.يمكن القول أن أي شخص يتفاخر بأن الحمض النووي يمكن إزالته تمامًا بدون DNase هو مشاغب.الحمض النووي عبارة عن بنية مزدوجة الشريطة مستقرة نسبيًا ، ولا يمكن القضاء عليها بمجرد التحدث والضحك.

تقييم التلوث
طريقة التقييم: كشف الرحلان الكهربي ، 1٪ الاغاروز ، 6 فولت / سم ، 15 دقيقة ، التحميل 1-3 ماي

التحليل الكمي للحمض النووي
يتم قياسه عادةً باستخدام مقياس الطيف الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية.اسمحوا لي أولاً أن أشيع معنى القيم الثلاث لـ OD260 و OD280 و OD230.
· OD260nm: الطول الموجي للامتصاص لأعلى ذروة امتصاص للحمض النووي ، وأفضل قيمة مقاسة تتراوح من 0.1 إلى 1.0.إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتخفيف العينة أو تركيزها لجعلها في النطاق.
· OD280nm: الطول الموجي للامتصاص لأعلى ذروة امتصاص للبروتين والمواد الفينولية.
· OD230nm: الطول الموجي للامتصاص لأعلى ذروة امتصاص للكربوهيدرات.

بعد ذلك ، دعنا نتحدث عن دور كل مؤشر.بالنسبة لـ A260 ، يمكن استخدامه لقياس إنتاجية الحمض النووي.عندما OD260 = 1 ، dsDNA = 50 ميكروغرام / مل ، ssDNA = 37 ميكروغرام / مل ، الحمض النووي الريبي = 40 ميكروغرام / مل.

من أجل النقاء ، نحتاج إلى النظر إلى النسب التي نراها عادة: OD260 / 280 و OD260 / 230.
· الحمض النووي النقي: OD260 / 280 يساوي 1.8 تقريبًا.عندما تكون أكبر من 1.9 ، فهذا يشير إلى وجود تلوث للحمض النووي الريبي ، وعندما يكون أقل من 1.6 ، فهذا يشير إلى وجود تلوث بالبروتين والفينول.
· الحمض النووي الريبي النقي: 1.7
· OD260 / 230: سواء كان DNA أو RNA ، فإن القيمة المرجعية هي 2.5.عندما يكون أقل من 2.0 فهذا يشير إلى وجود تلوث للسكر والملح والمواد العضوية.

سلامة الحمض النووي الريبي

من المهم جدًا قياس سلامة الحمض النووي الريبي.بشكل عام ، من الضروري إجراء تجربة هلام تمسخ الحمض النووي الريبي (RNA) للتحقق مما إذا كان السطوع بين 28S و 18S RNA عبارة عن علاقة ذات شقين.عندما يظهر النطاق الثالث 5S ، فهذا يعني أن الحمض النووي الريبي قد بدأ في التدهور ، باستثناء اللافقاريات.

بيانات تقييم جودة الحمض النووي الريبي (RNA): بالإضافة إلى الاختبارات المذكورة أعلاه ، هناك أيضًا بعض اختبارات الأجهزة الأكثر تقدمًا من حيث سلامة الحمض النووي الريبي ، مثل اختبار سلامة RQI لنظام Experion التلقائي الكهربائي ، والذي يمكنه اكتشاف ما إذا كان الحمض النووي الريبي يتحلل بشكل غير مرئي.

في البحث العلمي ، يعتبر PCR الكمي الفلوري مقارنة بين الجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي.لذلك ، في عملية حفظ عينة الحمض النووي الريبي ، واستخراج الحمض النووي الريبي ، وما إلى ذلك ، فإن الهدف الأساسي هو ضمان سلامة الحمض النووي الريبي.

يمكن فهم كيفية تأثير سلامة الحمض النووي الريبي على التوازن بين الجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي بسهولة من الشكل أدناه.سيؤدي التدهور إلى عدم اكتمال الجين ، سواء كان ذلك بسبب عدم اكتمال الجين المرجعي الداخلي أو عدم اكتمال الجين المستهدف ، فسيكون له تأثير كبير على البيانات.

يجب ألا يكون الرسم التخطيطي للجين المستهدف والجين المرجعي صحيحًا

اختبار التثبيط (سواء تم قمع قيمة التصوير المقطعي المحوسب في ظل التركيز العالي أو المنخفض أو ظروف أخرى)

بأخذ هذا الشكل كمثال ، تكون قيم Ct للمنحنيات الخمسة كما يلي.توزيع قيم CT بين المنحنيات غير متساوٍ ، وقيم Ct تتأخر في ظل التركيزات العالية والمنخفضة ، وهي حالة تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

النقطة الأساسية: في عملية استخراج الحمض النووي الريبي ، نحتاج إلى التخلي عن المفاهيم الخاطئة وإنشاء المفاهيم الصحيحة منها.

الفكرة الخاطئة هي: أن استخلاص الحمض النووي الريبي يتابع فقط العائد ، معتقدين أنه كلما زادت كمية الحمض النووي الريبي التي يتم الحصول عليها ، كان ذلك أفضل.في الواقع ، عندما نقوم بالتقدير الكمي ، إذا لم يكن عدد الجينات كبيرًا جدًا ، فإننا لا نحتاج إلى الكثير من الحمض النووي الريبي.كمية الحمض النووي الريبي التي تستخلصها أكثر من كافية.

المفهوم الصحيح هو:يجب أن يسعى استخراج الحمض النووي الريبي إلى النقاء والنزاهة والاتساق.يمكن للنقاء أن يضمن عدم منع النسخ العكسي اللاحق وأن البيانات لن تتأثر بالحمض النووي.تضمن النزاهة توازن التسلسلات المستهدفة والمراجع الداخلية.يضمن الاتساق تحميل عينة مستقر.

MIQE (4) - النسخ العكسي
مفهوم خاطئ: السعي وراء زيادة حجم العينة.
المفهوم الصحيح: متابعة الاتساق (الاستقرار) ، بغض النظر عن كمية الحمض النووي الريبي المحملة ، تظل كفاءة النسخ العكسي متسقة ، مما يضمن أن الاختلافات في (كدنا) يمكن أن تعكس حقًا الاختلافات في الرنا المرسال.
نفسر هذه العملية برسم تخطيطي:

رسم تخطيطي لكفاءة النسخ العكسي ، لا يكون صحيحًا
بادئ ذي بدء ، نحتاج إلى فهم الفرق بين عملية النسخ العكسي وعملية PCR.يخضع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لعمليات تسخين وتليين متعددة ، وينمو الجزء المستهدف بشكل كبير ؛في حين أن النسخ العكسي لا يحتوي على هذه العملية ، يمكننا أن نتخيل أن النسخ العكسي هو في الواقع واحد لواحد أثناء عملية النسخ ، مثل العديد من قطع RNA

نظرًا لأنه يمكن الحصول على أكبر عدد ممكن من أجزاء معلومات cDNA ، يجب فهمها الآن ، لأن الأجزاء الكبيرة والصغيرة قد تم نسخها عكسيًا ، ومن المستحيل التركيز على جزء واحد.ونظرًا لأن كمية الحمض النووي الريبي صغيرة نسبيًا ، فإن كمية الحمض النووي التي تم الحصول عليها صغيرة نسبيًا ، على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الذي له تأثير تضخيم ، لذلك من المستحيل اكتشافه.

نتائج الرحلان الكهربي (كدنا)
ثانيًا ، من الناحية المثالية ، يتم إجراء النسخ العكسي واحدًا لواحد ، ولكن لا يمكن لأي نسخة عكسية من أي شركة تحقيق هذا التأثير.في الأساس ، تتجول كفاءة معظم النسخ العكسية بين 30-50٪.إذا كانت هذه هي الحالة ، فإننا نفضل أن يكون لدينا كفاءة نسخ عكسي مستقرة نسبيًا ، وهو ما نريد أن نراه في الشكل: 3 RNAs تحصل على 2 cDNAs ، 6 RNAs تحصل على 4 cDNAs ، لذلك بغض النظر عن مقدار العينة المحملة ، فإن كفاءة النسخ العكسي مستقرة نسبيًا.لا نريد أن نرى الموقف الذي تكون فيه كفاءة النسخ العكسي غير مستقرة ويتم تثبيط التركيز العالي.

لذا ، كيف تتحقق مما إذا كانت كفاءة النسخ العكسي مستقرة؟الطريقة بسيطة للغاية ، ما عليك سوى إجراء اختبار مقارنة: أحدهما هو عكس النسخ إلى cDNA بعد مضاعفة تخفيف الحمض النووي الريبي ، والآخر هو إجراء تخفيف مضاعف بعد النسخ العكسي إلى cDNA ، ثم إجراء qPCR لمعرفة المنحدر الذي تم الحصول عليه هل هو ثابت.كطالب متفوق ، يجب أن تفهمه في ثوانٍ.كما هو مبين أدناه:

تمييع الحمض النووي الريبي (RNA) و (كدنا) لاختبار ما إذا كانت كفاءة النسخ العكسي مستقرة
النسخ العكسي والطقم
كيف يمكن أن يكون PCR الكمي الفلوري المثالي يحتوي على مجموعة ونسخة عكسية ممتازة.ينقسم النسخ العكسي تقريبًا إلى نوعين وفقًا للمصدر ، AMV أوM-MLV، وأداؤهم هو نفسه الذي يظهر في الجدول.

نشاط RNase H.
RNase H هو Ribonuclease H ، الاسم الصيني هو ribonuclease H ، وهو نوكلياز إندوريبوني يمكنه تحلل الحمض النووي الريبي على وجه التحديد في السلسلة الهجينة DNA-RNA.لا يمكن لـ RNase H تحلل روابط الفوسفوديستر في DNA أو RNA أحادي أو مزدوج السلسلة ، أي أنه لا يمكنه هضم الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أحادي أو مزدوج السلسلة.يشيع استخدامها في تخليق الخيط الثاني من (كدنا).

إنه شيء غريب.نقول أن النسخ العكسي يحتوي على نشاط RNase H ، وليس أن النسخ العكسي يحتوي على RNase H ، وقد لا يكون من الممكن فصل RNase H عن النسخ العكسي ، ربما بسبب تشكيل مجموعات معينة في النسخ العكسي.هذا النشاط ناتج عن النسخ العكسي.

لذلك ، بغض النظر عن كفاءة النسخ العكسي الأعلى لـ AMV ، فإن نشاط RNase H الخاص به يقلل من عائد cDNA.بالطبع ، يقوم مصنعو الكاشف بتحسين منتجاتهم باستمرار للتخلص من نشاط RNase H في النسخ العكسي قدر الإمكان لزيادة إنتاج cDNA.
درجة الحرارة الصلب

التركيب الثانوي للحمض النووي الريبي في درجات حرارة مختلفة
انظر الشكل أعلاه للهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي في درجات حرارة مختلفة ، واستخدم أداة mFold عبر الإنترنت لتحديد الهيكل الثانوي للجزء المستهدف تحت ظروف درجة حرارة معينة وتركيز الملح.عند 55 درجة مئوية ، لا يزال الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي معقدًا للغاية ، ولا يمكن أن يعمل النسخ العكسي ، ولا يمكن حل الهيكل الثانوي تمامًا حتى 65 درجة مئوية ، في حين أن درجة الحرارة المثلى لـ AMV و M-MLV أقل بكثير من درجة الحرارة هذه.
ما يجب القيام به؟الهيكل الثانوي هو الاقتران التكميلي للقالب نفسه ، مما يؤدي إلى منافسة قوية بين التمهيدي والنسخة العكسية والقالب ، مما يؤدي إلى سلسلة من المشكلات مثل انخفاض E وضعف التكرار.

ما يجب القيام به؟فقط قم بزيادة درجة حرارة التلدين قدر الإمكان.

يقوم العديد من مصنعي الكواشف بتحسين إنزيم النسخ العكسي من خلال الهندسة الوراثية.يزيد البعض من درجة حرارة التفاعل ، مثل Jifan و Aidelai ، والبعض الآخر يزيل المجموعة النشطة من إنزيم RNase H لتحسين التقارب بين الإنزيم وقالب RNA.يمكن للتقارب العالي الضغط بشكل تنافسي على الهيكل الثانوي وقراءته بسلاسة ، وكذلك تحسين كفاءة النسخ العكسي بشكل كبير.
النقطة الأساسية: يعد النسخ العكسي أكثر أهمية لمتابعة اتساق كفاءة النسخ العكسي (يجب ألا تكون الإنزيمات فعالة فحسب ، بل يجب أن تكون مستقرة أيضًا) ، بدلاً من كمية العينة المحملة ، إذا لم تكن PCR كميًا واسع النطاق بشكل خاص ، فلن يكون ذلك ممكنًا على الإطلاق.متعددة (كدنا).
بذلت العديد من الشركات المصنعة أيضًا بعض الجهود في السعي لتحقيق الاتساق.على سبيل المثال ، قامت معظم الشركات الآن بتعبئة النسخ العكسي كمجموعة قياسية للبيع ، وهو اختيار جيد.
على سبيل المثال ، مجموعات RT Easy Series من Foregene:

RT Easy I (Master premix for first strand cDNA synthesis kit)

MIQE (5) - معلومات الجين الهدف

يوضح الشكل أعلاه
1. يمكن التحقق بشكل عام من فعالية هذا الجين في التجارب المتكررة عن طريق التجارب المتكررة.
2. معرف الجينات ، كما تعلم.
3. طول الجين ، والطول الإجمالي للجين الهدف بالتأكيد لا توجد مشكلة.عند تصميم البادئات ، تأكد من أن طول amplicon يتراوح بين 80-200bp لضمان كفاءة تضخيم أفضل.
4. معلومات مقارنة الانفجار التسلسلي ، يحتاج الجين المستهدف للمقارنة في بنك الجينات لمنع التضخيم غير المحدد.
5. وجود الجينات الكاذبة.الجين الزائف هو تسلسل DNA مشابه للجين الطبيعي لكنه يفقد وظيفته الطبيعية.غالبًا ما يوجد في عائلة الجينات المتعددة من حقيقيات النوى.عادة ما يتم تمثيله بواسطة ψ.إنها نسخة DNA جينومية غير وظيفية في الجينوم تشبه إلى حد بعيد تسلسل الجين المشفر.، بشكل عام غير مكتوبة ، وليس لها معنى فسيولوجي واضح.
6. موقف الاشعال بالنسبة الى exons و introns.في السنوات الأولى ، عندما حللنا مشكلة تلوث الحمض النووي ، غالبًا ما اهتممنا بمواضع البادئات والإكسونات والإنترونات ، ونظرنا عمومًا في تصميم البادئات عبر الإنترونات لتجنب تضخيم الحمض النووي.يرجى الاطلاع على الشكل أدناه: يمثل الأسود introns ، ويمثل البلوز المختلف exons ، ويمثل اللون الوردي الاشعال المشترك ، ويمثل اللون الأحمر الساطع البادئات التي تمتد عبر intron.

تخطيطي ، غير صحيح أبدًا
يا لها من خطة مثالية تبدو هذه ، ولكن في الواقع ، في معظم الحالات ، لا تكون البادئات عبر إنترون سحرية كما هو متخيل ، كما أنها ستسبب تضخيمًا غير محدد.لذا فإن أفضل طريقة لمنع تلوث الحمض النووي هي إزالة الحمض النووي تمامًا.
7. توقع التشكل.باستخدام هذا المثال مرة أخرى ، استخدم أداة mFold عبر الإنترنت لتحديد البنية الثانوية للجزء المستهدف عند درجة حرارة معينة وتركيز ملح.

التركيب الثانوي للحمض النووي الريبي في درجات حرارة مختلفة
الهيكل الثانوي هو الاقتران التكميلي للقالب نفسه ، مما سيؤدي إلى منافسة قوية بين التمهيدي وإقران القالب ، وتكون فرص الربط التمهيدي أقل ، مما يؤدي إلى سلسلة من المشكلات مثل انخفاض E وضعف التكرار.من خلال تنبؤات البرامج ، إذا لم تكن هناك مشكلة هيكلية ثانوية ، فسيكون ذلك رائعًا.إذا كان هناك ، فستناقش مقالة المتابعة الخاصة بنا على وجه التحديد كيفية حل هذه المشكلة.

MIQE (6) - أوليغنوكليوتيدات qPCR

بالنسبة لـ PCR الكمي الفلوري ، فإن أول شيء تواجهه كل يوم هو استخراج الحمض النووي الريبي ، والشيء الثاني قد يكون التصميم التمهيدي.
بادئ ذي بدء ، ما زلنا نتحقق من القواعد المتعلقة بتصميم التمهيدي وفقًا لقائمة التحقق من MIQE.من السهل جدًا أن يضحك المحتالون ، ويمكننا الانتهاء منه في جملة واحدة: اكتشف تسلسل وموضع المسبار التمهيدي وطريقة التعديل.بالنسبة لطريقة تنقية التمهيدي ، يعتبر تخليق التمهيدي رخيصًا جدًا في الوقت الحالي ، ويستحق qPCR PAGE وطرق التنقية أعلاه ، والمعلومات الخاصة بأداة التوليف ليست مهمة.يقوم العديد من الأشخاص بعمل البادئات منذ عقود ولا يعرفون أن المركب هو ABI3900.
فيما يتعلق بمبادئ التصميم التمهيدي ، لا يتعين عليك حفظها عن ظهر قلب ، لأن معظم برامج التصميم التمهيدي أو الأدوات عبر الإنترنت يمكن أن تتعامل مع هذه المشكلات (يوصى باستخدام الأداة عبر الإنترنت primer3.ut.ee/) ، و 99.999٪ من التصميم التمهيدي لا يتم يدويًا.
فقط تحقق من النقاط التالية بعد تصميم البرايمر:
1. تصميم الاشعال بالقرب من الطرف 3: في حالة استخدام بادئات oligo dT لتخليق cDNA أول حبلا ، مع الأخذ في الاعتبار كفاءة النسخ العكسي وسلامة الحمض النووي الريبي ، يجب تصميم الاشعال المصمم بالقرب من الطرف 3 لتحسين كفاءة التضخيم.استخدم صورة لشرح ما يلي (لا توجد طريقة لفهم هذا):

لماذا يجب تصميم البرايمر بالقرب من الطرف 3 ، يجب ألا يكون ذلك صحيحًا
2. قيمة TM: قيمة Tm عند 55-65 درجة مئوية (لأن نشاط نوكلياز خارجي هو الأعلى عند 60 درجة مئوية) ، ومحتوى GC عند 40٪ -60٪.
3. الانفجار: من أجل تجنب التضخيم غير المحدد للجينوم ، يجب استخدام Blast للتحقق التكميلي.

MIQE (7) - عملية qPCR

1. مجموعة qPCR
وفقًا لمتطلبات MIQE ، يجب أن نصف بوضوح شروط التفاعل الكاملة في المقالة ، بما في ذلك تكوين نظام تفاعل PCR ، وما هي المجموعة المستخدمة ، ومن هي الشركة المصنعة ، وما حجم نظام التفاعل ، وما إذا كانت طريقة الصبغة أو طريقة الفحص مستخدمة ، أو إعدادات برنامج PCR.سيجد السائقون المخضرمون بالتأكيد أنه طالما تم تحديد المجموعة ، يتم تحديد المعلومات المذكورة أعلاه بشكل أساسي.
في الوقت الحاضر ، يعد تصنيع وإنتاج مجموعات PCR الكمية الفلورية تقنية ناضجة للغاية.طالما أنك لا تختار مصنّعين سيئين للغاية ، فإن احتمال حدوث مشاكل ليس مرتفعًا ، لكننا ما زلنا نرغب في مشاركة بعض النقاط معك:
إنزيم طق البدء الساخن:الجزء الأكثر أهمية في تفاعل البوليميراز المتسلسل هو إنزيم طق سريع البدء.تنقسم إنزيمات البدء الساخن الموجودة في السوق عمومًا إلى نوعين ، أحدهما عبارة عن إنزيم البدء الساخن المعدل كيميائيًا (يمكنك تخيله على أنه إنزيم برافين مدمج) ، والآخر هو إنزيم البدء الساخن لتعديل الجسم المضاد (ربط الجسم المضاد بالمستضد).يعد التعديل الكيميائي طريقة مبكرة لإنزيمات البدء الساخن.عندما يتم الوصول إلى درجة حرارة معينة ، فإن الإنزيم سيطلق نشاطه.يستخدم إنزيم البدء الساخن المعدل بالأجسام المضادة طرقًا بيولوجية لمنع نشاط الإنزيم.عندما يتم الوصول إلى درجة حرارة معينة ، سيتم تغيير طبيعة الجسم المضاد وتعطيله كبروتين ، وسيتم تشغيل نشاط الإنزيم.

ومع ذلك ، ما فائدة هذا؟هذا هو الحال ، فإن نشاط إطلاق الإنزيمات المعدلة بالأجسام المضادة يكون أسرع من نشاط الإنزيمات المعدلة كيميائيًا ، لذلك من حيث الحساسية ، تتمتع الإنزيمات المعدلة بالأجسام المضادة بميزة طفيفة ، بحيث لا توجد إنزيمات معدلة كيميائيًا في المجموعات الموجودة في السوق.إذا كان هناك ، فإن تقنية هذه الشركة المصنعة لا تزال عالقة في عصر الألفية.
تركيز أيون المغنيسيوم:تركيز أيون المغنيسيوم مهم جدا في تفاعل PCR.يمكن أن يعزز تركيز أيون المغنيسيوم المناسب إطلاق نشاط إنزيم Taq.إذا كان التركيز منخفضًا جدًا ، فسيتم تقليل نشاط الإنزيم بشكل كبير ؛إذا كان التركيز مرتفعًا جدًا ، فسيتم تعزيز التضخيم غير النوعي المحفز بالإنزيم.سيؤثر تركيز أيونات المغنيسيوم أيضًا على تلدين البادئات ودرجة حرارة انصهار القالب ومنتجات PCR ، مما يؤثر على محصول الأجزاء المضخمة.يتم التحكم عمومًا في تركيز أيونات المغنيسيوم عند 25 ملي مولار.بالطبع ، للحصول على مجموعة جيدة ، يجب التحكم جيدًا في تركيز أيونات المغنيسيوم.يضيف بعض التجار عامل مخلب أيون المغنيسيوم إلى الكاشف ، والذي يمكن أن يحقق تأثير الضبط التلقائي لتركيز أيون المغنيسيوم.
تركيز الصبغة الفلورية:تولد الصبغة الفلورية ، وهي SYBR Green التي نستخدمها عادةً ، مضانًا بشكل أساسي من خلال الارتباط بالأخدود الصغير للحمض النووي مزدوج الشريطة ، لأن ارتباط الصبغة بالحمض النووي مزدوج الشريطة غير محدد ، وهذا يعني أنه طالما يتم دمج الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل معه ، يمكن أن يحدث التألق ، لذلك ستجمع إشارات الثنائيات الأولية وقوالب الحمض النووي في النظام.
ملاحظة: نظرًا لخصائصها الحساسة للضوء ، فإن المنتجات الموجودة في السوق يتم تعبئتها بشكل عام في أنابيب طرد مركزي بنية غير شفافة (كما هو موضح في الصورة أدناه).ومع ذلك ، سيواجه هذا مشكلة.من الصعب معرفة ما إذا كان السائل يُمتص عند أخذ العينات.في هذا الصدد ، تعتبر Qingke بالفعل الأكثر سهولة في الاستخدام (كما هو موضح في الصورة أدناه) ، ويتم تعبئة الأنبوب الشفاف في كيس من الصفيح غير الشفاف.ثم ضعه في كيس من الصفيح ، مع مراعاة سهولة تجنب الضوء وأخذ العينات.يجب عليك اختيار رقم المنتج الصحيح.TSE204 هو وجود فائق الفعالية من حيث التكلفة ، مما يجعلني أرغب في زراعة العشب.

كما أن تركيز الصبغة الفلورية مهم جدًا.إذا كان التركيز منخفضًا جدًا ، فلن يرتفع منحنى التضخيم في المرحلة اللاحقة ولن يكون مثاليًا ؛إذا كان التركيز مرتفعًا جدًا ، فسوف يتسبب ذلك في حدوث تداخل مع الضوضاء.نظرًا لأن PCR الكمي الفلوري يعتمد بشكل أساسي على قيمة CT ، إذا لم يتم ضبط تركيز الصبغة الفلورية بشكل صحيح ، فإن النقطة المنخفضة تكون أفضل من النقطة العالية.بالطبع ، تركيز الصبغة المناسب هو الأفضل.

ROX: تُستخدم أصباغ ROX لتصحيح أخطاء إشارة الفلورة جيدًا.تتطلب بعض الشركات المصنعة للأجهزة المعايرة ، في حين أن البعض الآخر لا يتطلب ذلك.على سبيل المثال ، يتطلب استخدام أداة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (Real Time PCR) من Thermo Fisher Scientific عادة المعايرة ، بما في ذلك 7300 ، 7500 ، 7500Fast ، StepOnePlus ، إلخ. تعليمات المجموعة العامة سوف تصفها.
يحتوي Foregene's qPCR Mix أيضًا على صبغة ROX ، وهو مناسب للاستخدام في طرز مختلفة.

الوقت الحقيقي PCR Kit-Taqman

علاج ضعف الروابط الهيدروجينية: تعتبر معالجة الروابط الهيدروجينية الضعيفة مسألة تقنية نسبيًا.لم يقرأ أي شيء كتيبات العديد من المجموعات ، لكن لم يذكر أي منها هذا الموضوع.في الواقع ، إنه مهم للغاية.يعتمد مزيج القواعد بشكل أساسي على قوة الروابط الهيدروجينية.روابط الهيدروجين القوية تضخيم طبيعي ، وتؤدي الروابط الهيدروجينية الضعيفة إلى تضخيم غير محدد.إذا كان لا يمكن التخلص من الروابط الهيدروجينية الضعيفة جيدًا ، فلا يمكن تجنب التضخيم غير المحدد.في نطاق المؤلف ، لاحظ عدد قليل فقط من الشركات هذه المشكلة.عند شراء المجموعة ، يمكنك الرجوع إلى ما إذا كنت قد فكرت في حل في هذا الصدد للمجموعة التي تريد اختيارها.

حجم التفاعل: يعتبر نظام 20-50ul أكثر شيوعًا ، ومن المحتمل أن تتسبب الأحجام الصغيرة في حدوث أخطاء.بشكل عام ، ستوصي تعليمات المجموعة باستخدام أحجام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.لا تكن ذكيًا واستخدم أحجامًا أصغر لتوفير التكاليف.هدف.لقد تم بالفعل اختبار الحجم الموصى به من قبل التجار ، وقد لا يتمكنون من حل مشكلة الأخطاء التي تسببها الأحجام الصغيرة.
2. الصانع ورقم المادة للوحة الأنبوب
يعلم الجميع مبدأ الفلورسنت الكمي PCR.يتم جمع الإسفار بشكل أساسي من خلال أغطية أنابيب PCR.عند اختيار مستهلكات PCR ، انتبه إلى نقطتين: نقل ضوء جيد ومناسب للأداة.بشكل عام ، اللوحات والأنابيب الخاصة بالعلامات التجارية السائدة جيدة ، ولكن عليك أن تختار بعناية من حيث التكيف ، وإلا فلن تتمكن من استخدام الأداة.

4. أعلى مستوى من المعرفة

MIQE (8) - التحقق من صحة qPCR
هذه هي الأولوية القصوى لـ qPCR!لقد سقط الكثير من الأبطال في الرمال هنا.بالطبع ، من الممكن أيضًا أن تكون محظوظًا وأن الجينات التي درستها بسيطة ، لذا فقد طفت عبر الكهف الجليدي على طول الريح.تهدف معلومات التحقق الخاصة بـ qPCR إلى اختبار موثوقية البيانات.ندرج معلومات التحقق اللازمة على النحو التالي:

1- اختبار النوعية
يتم اختبار خصوصية تضخيم الجين المستهدف عن طريق التحقق مما إذا كانت صورة الرحلان الكهربائي هي نطاق واحد ؛التحقق من التسلسلمنحنى الانصهار لمعرفة ما إذا كانت خريطة الذروة مفردة ؛التحقق من هضم الإنزيم وطرق أخرى.
هنا ، نركز على tتحليل التضخيم غير النوعي باستخدام طريقة ذوبان المنحنيات.بشكل عام ، عندما نصمم مواد أولية ، يجب أن يكون حجم جزء المنتج في نطاق 80-200 نقطة في البوصة ، مما يجعل درجة حرارة انصهار منتج PCR تتراوح بين 80-85 درجة مئوية.لذلك ، إذا كانت هناك قمم متنوعة ، فيجب أن تكون هناك منتجات تضخيم أخرى غير محددة ؛إذا ظهرت الذروة أقل من 80 درجة مئوية ، فيُعتبر عمومًا ثنائيًا تمهيديًا ؛إذا ظهرت الذروة أعلى من 85 درجة مئوية ، فإنها تعتبر عمومًا تلوثًا للحمض النووي أو تضخيمًا غير محدد لشظايا كبيرة.
ملحوظة: في بعض الأحيان توجد قمة واحدة فقط عند 80 درجة مئوية.في هذا الوقت ، يجب الالتزام بهذا المفهوم.من المحتمل أن تكون نتائج التضخيم كلها ثنائيات أولية.

منحنى الانصهار الطبيعي (ذروة واحدة بدون تضخيم غير محدد)

منحنى الذوبان الإشكالي (تضخيم غير محدد للقمم الزائفة)
【تحليل حالة】

هناك ذروة رئيسية ، ولكن ديمر التمهيدي خطير
يمكن لمنحنى الذوبان أحادي الذروة في الشكل أدناه أن يخدع عينيك بسهولة ، معتقدًا أنها تجربة مثالية ، لكن النتيجة خاطئة تمامًا.في هذا الوقت ، علينا أن ننظر إلى درجة حرارة الانصهار.تكون درجة حرارة الذروة أقل من 80 درجة مئوية ، وهي عبارة عن مادة أولية بالكامل.

لا يوجد جزء مستهدف ، كل ثنائيات البرايمر
هنا ، أخي لا يستطيع التوقف.الصورة أدناه عبارة عن صورة تم التقاطها بهاتف محمول أرسل لي من قبل scumbag.الكواشف التي استخدمها كلها علامات تجارية شائعة الاستخدام في الصناعة.لقد تغير من علامة T-prefix إلى علامة تجارية أخرى لـ T-prefix.أعتقد أنك خمنت ذلك بالفعل.صرخ القذر في وجهي: "الكاشف المستخدم في الصورة الأولى جيد جدًا ، والذروة مفردة.في وقت لاحق ، بعد استخدام الكاشف الذي أوصيت به ، يصبح مثل الصورة الثانية ، بقمم مختلطة.لقد جعلتني بائسا."
افصل بين الرسمين البيانيين.للوهلة الأولى ، يكون لأحدهما قمة واحدة ، والآخر له قمة مزدوجة.هراء ، ذروة واحدة هي بالطبع جيدة.هل هذا صحيح؟
أسوأ من Dou E ، إذا وضعت الصورتين في الصورة أدناه ، فستفهم على الفور.في الواقع ، يصيبنا هذا النوع من الصور بالشلل بسهولة.بعد تحليل دقيق ، وجدنا أن: ذروة الشكل الأول عند 75 درجة مئوية ، وهي عبارة عن ديمر تمهيدي تمامًا ؛تظهر ذروة الشكل الثاني عند 75 درجة مئوية و 82 درجة مئوية ، على الأقل هناك يظهر المنتج.

صور ردود الفعل من الطلاب
لذا فإن المشكلة الأساسية ليست مشكلة الكواشف ، ولكن مشكلة التصميم التمهيدي.في الوقت نفسه ، يثبت أيضًا أن بعض العلامات التجارية الكبرى ليست ذات جودة حديدية ، كما أنه يثبت ما قاله أخي من قبل: إنها ليست ماركة الكاشف التي تدعم مقالتك.إن مقالتك هي التي دعمت العلامة التجارية للكواشف.فقط تخيل ، إذا لم يغير الخبث الكواشف ، فسيتم إرسال البيانات الخاطئة إلى المجلة ، وما سيحدث سيكون مأساة.
2. قيمة ط م لعنصر تحكم فارغ
لا تشرح ، إذا كان لعنصر التحكم الفارغ قيمة Ct ، أليس هذا تلوثًا؟ومع ذلك ، ما زلت بحاجة إلى فهم عنصر التحكم الفارغ الذي له قيمة Ct.إذا كان NTC ، فهذا يعني أن هناك DNA غريب مثل تلوث الكاشف.إذا كان العلاج ببدائل النيكوتين ، فهذا يعني أن الحمض النووي الريبي المستخرج ملوث بالحمض النووي.
3. منحنى قياسي
بما في ذلك معادلة المنحدر والحساب ، يمكن حساب كفاءة PCR من خلال الصيغة.تتطلب التجربة المثالية ميل المنحنى القياسي ليقترب من 3.32 و R² ليقترب من 0.9999.
4. المدى الديناميكي الخطي
النطاق الديناميكي للتفاعل خطي.وفقًا للقالب المستخدم لإنشاء المنحنى القياسي ، يجب أن يشتمل النطاق الديناميكي على 5 تدرجات تركيز على الأقل ، مع الانتباه إلى تغيير قيم Ct عند تدرجات التركيز العالي وتدرجات التركيز المنخفض.
5. دقة الكشف
التغييرات في نتائج qPCR ، أي ضعف التكرار ، أي ضعف الدقة ، ناتجة عن العديد من العوامل ، بما في ذلك درجة الحرارة والتركيز والتشغيل.تصبح دقة qPCR بشكل عام أقل قابلية للتحكم مع انخفاض عدد النسخ.من الناحية المثالية داخل التباين التجريبي ، يجب أن يكون هذا الاختلاف التقني متميزًا عن التباين البيولوجي ، ويمكن أن تعالج التكرارات البيولوجية الفروق الإحصائية في نتائج qPCR بين المجموعات أو العلاجات.على وجه الخصوص بالنسبة للمقايسات التشخيصية ، يجب الإبلاغ عن أفضل دقة للمقايسة البينية (قابلية التكرار) عبر المواقع والمشغلين.
6. كفاءة الكشف و LOD (في تعدد الإرسال qPCR)
اللد هو أقل تركيز بنسبة 95٪ من العينات الإيجابية المكتشفة.بمعنى آخر ، يجب ألا يتجاوز تركيز اللد الموجود داخل مجموعة مكررات الجينات المستهدفة 5٪ من التفاعلات الفاشلة.عند إجراء تحليل متعدد الإرسال qPCR ، خاصةً للكشف المتزامن للطفرات النقطية أو الأشكال المتعددة ، يحتاج تعدد الإرسال qPCR إلى تقديم دليل على أن دقة الشظايا المتعددة المستهدفة لا تتعرض للخطر في نفس الأنبوب ، ويجب أن تكون كفاءة الكشف المتعدد والأنبوب الواحد و LOD هي نفسها.خاصة عندما يتم تضخيم الجينات المستهدفة عالية التركيز والجينات المستهدفة منخفضة التركيز في وقت واحد ، يجب الانتباه إلى هذه المشكلة.
المشاكل والحلولبشكل عام ، تركز المشكلات التي غالبًا ما يتم مواجهتها في تصحيح أخطاء qPCR على الجوانب التالية:
· تضخيم غير محدد
· صعوبة اختيار تركيز البرايمر ومشكلة مع الثنائيات الأولية
· درجة حرارة التلدين غير دقيقة
· تؤثر البنية الثانوية على كفاءة التضخيم
تضخيم غير محدد
تضخيم غير محدديحدث ، يُنظر عمومًا إلى ما إذا كان تصميم التمهيدي غير مناسب ، ولكن إذا لم تكن في عجلة من أمرك لتغيير البرايمر ، فيمكنك تجربة الطرق التالية أولاً (يتم إرفاق المبدأ أيضًا):
· زيادة درجة حرارة التلدين - محاولة جعل الروابط الهيدروجينية الضعيفة غير قادرة على الحفاظ عليها ؛
· تقصير وقت التلدين والاستطالة - تقليل فرص ضعف الروابط الهيدروجينية ؛
· تقليل تركيز التمهيدي - تقليل فرصة ارتباط البادئات الزائدة عن الحاجة والمناطق غير المستهدفة ؛
كفاءة تضخيم منخفضة
الوضع المعاكس للتضخيم غير المحدد - كفاءة التضخيم المنخفضة ، والتدابير للتعامل مع كفاءة التضخيم المنخفضة هي عكس ذلك تمامًا:
· إطالة وقت التلدين والاستطالة.
· التغيير إلى ثلاث خطوات PCR وتقليل درجة حرارة التلدين.
· زيادة تركيز البرايمر.
Ps: العديد من طلاب الدراسات العليا المولودين في التسعينيات غير راغبين في دراسة كيفية تصحيح التجارب ، ويأملون أن تتمكن المجموعة من حل المشكلة تمامًا (إذا كنت تريد الذهاب إلى شركة كواشف لإجراء البحث والتطوير بعد التخرج) ، في الواقع ، يعتقد مصنعو الكواشف أيضًا بهذه الطريقة ، آمل أن يكون ذلك أحمق يمكن استخدامه عندما تحصل عليه ، لذلك أنفق مصنعو الكواشف الكثير من الجهد في حل مشكلة التضخيم الضعيفة ، بما في ذلك مقدمة الكواشف.لحل المشكلة بسهولة ، لا يزال يتعين على الحمقى قراءة مقدمة شركة الكاشف لمعرفة ما إذا كان هناك عامل يمتص روابط الهيدروجين الضعيفة.
صعوبة اختيار تركيز البرايمر ومشكلة مع الثنائيات الأولية
طريقة 1: بشكل عام ، تحتوي تعليمات المجموعة الخاصة بـ qPCR على أنظمة موصى بها وتركيزات التمهيدي الموصى بها.
الطريقة الثانية: التصحيح عن طريق تحديد تدرج تركيز التمهيدي.الصورة أدناه مسروقة من شركة لتوضيحها.يوضح الشكل أدناه النتائج الكمية الفلورية التي تم إجراؤها باستخدام ثلاثة تدرجات تركيز أولية (100 نانومتر ، 250 نانومتر ، 500 نانومتر) وأربعة تدرجات تركيز للقالب (0.1 نانوغرام ، 1 نانومتر ، 10 نانومتر ، 100 نانومتر).يتم رسم قيمة Ct للنتائج التجريبية على النحو التالي:

تحديد تركيز التمهيدي يربط كل تركيز تمهيدي في خط على النحو التالي:

اختيار تركيز التمهيدي واضح ، والعلاقة الخطية لتركيز التمهيدي من 100 نانومتر و 250 نانومتر أفضل ، والعلاقة الخطية لتركيز التمهيدي البالغ 500 نانومتر ضعيفة نسبيًا.في 100 نانومتر و 250 نانومتر ، تكون قيمة Ct البالغة 250 نانومتر صغيرة نسبيًا ، لذا فإن تركيز التمهيدي الأمثل هو 250 نانومتر.يمكن رؤية ثنائيات التمهيدي الشديدة بشكل عام في منحنى الذوبان.ماذا لو لم تتمكن البادئات المصممة من تجنب الثنائيات الأولية؟
الطريقة الثالثة: تقليل كمية البرايمر وزيادة درجة حرارة التلدين (لا داعي للشرح).
القيمة التجريبية لدرجة حرارة التلدين هي 60 درجة مئوية.إذا لم تكن متأكدًا ، كيف تختار درجة حرارة التلدين الأكثر ملاءمة؟الجواب هو نفسه اختيار تركيز التمهيدي -اختبار التدرج.التقط صورة من شركة Bio-rad لتوضيح المشكلة.لتضخيم جزء مستهدف معين ، قم بتعيين ثمانية تدرجات درجة حرارة ، كل منها بثلاثة تكرارات ، ومنحنى التضخيم الذي تم الحصول عليه على النحو التالي:

اختيار درجة حرارة التلدين:
· 70 درجة مئوية ، 69 درجة مئوية - بشكل أساسي ، لا يمكن دمج البادئات ، لذلك لا يوجد تضخيم.
· 67.3 درجة مئوية - يوجد مقدار ضئيل من التضخيم في البداية ، وقيمة Ct كبيرة نسبيًا.
· 64.5 درجة مئوية —- انخفاض قيمة Ct.
· عند 60.7 درجة مئوية ، و 58.0 درجة مئوية ، و 56.2 درجة مئوية ، و 55.0 درجة مئوية ، تميل قيم Ct بشكل أساسي إلى الاستقرار ، ولكن قيم التألق النهائية كانت مختلفة.
كيفة تختار؟المبدأ: المبدأ الأول هو قيمة Ct الأعلى.للحصول على نفس قيمة Ct ، اختر درجة حرارة تلدين أعلى لتجنب dimerization والتضخيم غير المحدد.على الرغم من وجود قيمة مضان أعلى عند 55 درجة مئوية ، فقد يكون هناك ثنائيات أو تضخيم غير محدد فيه.
ولكن إذا كنت ذكيًا مثلك ، فستفكر بالتأكيد: من الناحية المنطقية ، إذا كان تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) محددًا للغاية ، طالما أن تركيز التمهيدي يتجاوز الحد الأدنى من المتطلبات ، فلن يكون للنقاط المرتفعة والمنخفضة أي تأثير ، تمامًا مثل الأصباغ الفلورية و dNTPs.في الواقع ، طالما تم تحسين درجة حرارة التلدين بشكل صحيح ، فسيتم تقليل تأثير تركيز التمهيدي على قيمة Ct بشكل طبيعي.

تم تحسين درجة حرارة التلدين بشكل صحيح ، وسيتم تقليل تأثير تركيز التمهيدي على CT
يؤثر الهيكل الثانوي على كفاءة التضخيم
لنأخذ الصورة من Bio-rad لتوضيح المشكلة.كما أنه يصمم تدرجًا لدرجة الحرارة لتضخيم جين له بنية ثانوية.

يظهر الهيكل الثانوي
يمكن ملاحظة أنه مع انخفاض تدرج درجة الحرارة ، تبدأ المنتجات في الظهور وتتحرك قيمة Ct للأمام ، لتصل إلى الحد الأدنى للقيمة عند 60.7 درجة مئوية ، وبعد ذلك مع انخفاض تدرج درجة الحرارة ، تصبح قيمة Ct أكبر.على العكس من ذلك ، مع زيادة درجة الحرارة ، يتم فتح الهيكل الثانوي وزيادة كفاءة التضخيم.بعد الوصول إلى درجة حرارة معينة ، لا تؤدي زيادة درجة الحرارة إلى تحسين كفاءة التضخيم.لأنه لا يمكن الجمع بين البرايمر بشكل ثابت في هذا الوقت.لذلك،ابحث عن درجة الحرارة بأقل قيمة Ct، وهي أفضل درجة حرارة لتضخيم قالب الهيكل الثانوي!بالطبع ، يجب أن يعرف الحمقى الأذكياء أنه إذا لم يكن ذلك ضروريًا ، فمن الأفضل تغيير الاشعال وتجنب منطقة البنية الثانوية.
5. مستوى التطبيق
MIQE - تحليل البيانات

يتم إجراء تحليل البيانات بشكل أساسي بواسطة أداة PCR الكمية الفلورية.في المقالة السابقة ، تم إنجاز الكثير من أعمال تحليل البيانات ، مثل عنصر التحكم الفارغ ، والذي تم شرحه في تصميم التجربة.تم توضيح الجينات المرجعية الداخلية ، والأرقام المتكررة ، وما إلى ذلك.، هنا نشرح بشكل أساسي تطبيق qPCR.
يستخدم qPCR على نطاق واسع ، والتحقق التجريبي وتشخيص الحمض النووي هما السيناريوهات الأكثر استخدامًا.
القياس الكمي المطلق
السجل (التركيز الأولي) له علاقة خطية مع عدد الدورات.يمكن استخلاص منحنى قياسي من معيار برقم نسخة أولية معروف ، أي أنه يمكن الحصول على العلاقة الخطية لتفاعل التضخيم.وفقًا لقيمة Ct للعينة ، يمكن حساب التركيز في العينة.مقدار القوالب المراد تضمينها.

طريقة الحساب الكمي المطلق
يجب أن يعتمد التقدير الكمي المطلق على المنحنى القياسي.لعمل منحنى قياسي ، يلزم وجود معيار.عادةً ما يكون المعيار هو البلازميد الذي يتم الحصول عليه عن طريق استنساخ الجين المستهدف.لماذا هو بلازميد؟لأن DNA البلازميد الدائري هو الأكثر استقرارًا.خفف المنتج القياسي في 5 إلى 6 درجات وفقًا لنسبة المضاعفة (10 أضعاف التخفيف) ، وانتبه إلى التوحيد عند التخفيف.دع قيمة Ct تقع بين 15-30.

إعداد قياسي
في الوقت نفسه ، يجب أيضًا تخفيف العينة المراد اختبارها وفقًا لذلك (تذكر عامل التخفيف) ، ويجب أيضًا أن تقع قيمة Ct بين 15-30.يتم وضع المنتج القياسي + العينة المراد اختبارها على الجهاز معًا.بعد التشغيل ، تم عمل منحنى قياسي باستخدام المادة القياسية ، وتم إحضار العينات المراد اختبارها إلى المنحنى القياسي لحساب التركيز.
يعد القياس الكمي لفيروس التهاب الكبد B لفيروس HBV مقياسًا كميًا مطلقًا نموذجيًا ، والذي يمكنه حساب عدد نسخ الفيروس في 1 مل من الدم.
حساب رقم النسخة
تركيز العينة المراد اختباره (نانوغرام / ul) = OD260 × 50ug / ml × عامل التخفيف
الوزن الجزيئي للعينة = عدد القواعد × 324
رقم نسخة العينة المراد اختبارها (نسخ / ul) = تركيز العينة المراد اختبارها / الوزن الجزيئي للعينة × 6 × 1014

طريقة حساب رقم النسخة

ما سبق هو طريقة الحساب لتحديد الكمية.هذه مشكلة رياضية يمكن حلها بعد التخرج من المدرسة الإعدادية ، ويتم حل المشكلات الرياضية بشكل عام بواسطة أجهزة الكمبيوتر.إذا كنت لا تفهم ، يمكنك التواصل.
القياس النسبي
يستخدم القياس النسبي بشكل رئيسي في البحث العلمي.كم عدد الفيروسات الموجودة في 1 مل من الدم ، وهو فيروس DNA ، هذا حدث حتمي نسبيًا: يمكن تحديد كمية الدم ، وفيروس الحمض النووي مستقر نسبيًا.ومع ذلك ، يصعب علينا مقارنة عدد نسخ النسخ لجين معين في الورقة ، لأنه من الصعب تحديد حجم الورقة ووزنها وطراوتها ، كما يصعب تحديد كمية الحمض النووي الريبي المستخرج ، كما يصعب تحديد كفاءة النسخ العكسي ، أي أن أي خطوة قد تجعل البيانات التجريبية بها أخطاء ولا يمكن استخدامها.
لذلك ، يجب أن يقدم القياس النسبي عنصرًا:الجين المرجعي الداخلي.
بمعنى آخر ، القياس الكمي النسبي هو في الواقع مقارنة بين الجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي.بالمقارنة مع نفس الأنسجة ونفس الخلية ، فإن تأثير حجم العينة ، وكمية استخراج الحمض النووي الريبي ، وكفاءة النسخ العكسي ، وكفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل صغير نسبيًا.بسبب حجم العينة الصغير ، تم تقليل الجينات المرجعية الداخلية والجينات المستهدفة نسبيًا.هذا هو السبب في أننا أكدنا من قبل على التوحيد والاستقرار.
الجينات المرجعية الداخلية بشكل عامجينات التدبير المنزلي(جينات حفظ المنزل) ، والتي تشير إلى فئة من الجينات التي يتم التعبير عنها بثبات في جميع الخلايا ، ومنتجاتها ضرورية للحفاظ على أنشطة الحياة الأساسية للخلايا.
لا تخلط بين هذا المفهوم.جينات التدبير المنزلي هي مصطلحات وظيفية بيولوجية ، بينما الجينات المرجعية الداخلية هي مصطلحات فنية تجريبية.تحتاج جينات التدبير المنزلي إلى اجتياز التحقق من الصحة قبل أن يتم اختيارها كجينات مرجعية داخلية.
على سبيل المثال ، اخترنا العديد من جينات التدبير المنزلي في الشكل أدناه لاختبار مستويات تعبيرها في خلايا الأنسجة المختلفة ، ووجدنا أن مستويات التعبير عن β-2-microglobulin كانت مختلفة تمامًا عن تلك الموجودة في الجينات الثلاثة الأخرى ، لذلك لا يمكن استخدامها كجينات مرجعية داخلية.

بعد فهم وظيفة التصحيح للجين المرجعي الداخلي ، يتم اشتقاق خوارزميتين بسبب إدخال الجين المرجعي الداخلي.
· طريقة منحنى المعايير المزدوجة
· طريقة 2 - △△ Ct (طريقة مقارنة قيمة CT)
إذا كنت مهتمًا بدراسة الأنواع ووظائف الجينات ، فيرجى التخلي عن البحث عن الخوارزميات واستخدام الصيغ مباشرة ، أو استخدام الآلات مباشرة ؛إذا كنت شابًا مستقيمًا في الرياضيات والهندسة ، فلا تتردد.
طريقة منحنى المعايير المزدوجة
حدد الجين المستهدف وجين التدبير المنزلي لعينة التحكم والعينة المراد اختبارها من خلال المنحنى القياسي ، ثم احسب القيمة النسبية وفقًا لصيغة الحساب ، وهي مستوى التعبير النسبي.
المزايا: تحليل بسيط ، تحسين تجريبي بسيط نسبيًا
العيب: لكل جين ، كل جولة من التجارب يجب أن تشكل منحنى قياسي
التطبيق: إحدى الطريقتين الكمية النسبية الأكثر استخدامًا والمعترف بها في دراسة تنظيم التعبير الجيني
الصيغة كما يلي:

الأمثلة هي كما يلي:

احسب المقدار النسبي بناءً على النتيجة الكمية
2 - طريقة Ct (طريقة مقارنة قيمة CT)

المزايا: لا حاجة لعمل منحنى قياسي
العيوب: من المفترض أن تكون كفاءة التضخيم قريبة من 100٪ ؛الانحراف المعياري <5٪ ، ويفترض أن يكون المنحنى القياسي والكفاءة بين كل تضخيم متسقين ؛يعد تحسين الظروف التجريبية أكثر تعقيدًا.
التطبيق: إحدى الطريقتين الكمية النسبية الأكثر استخدامًا والمعترف بها في دراسة تنظيم التعبير الجيني

بالطبع ، من المستحيل عادةً أن تكون كفاءة التضخيم مثالية. 1. طريقة التصحيح: إذا علمنا أن الجين المستهدف والجين المرجعي لهما نفس كفاءة التضخيم ، لكن كفاءة التضخيم لا تساوي 1 ، فيمكن تصحيح 2－ △△ Ct على النحو التالي: (1 + E) - △△ Ct ، على سبيل المثال ، إذا كانت كفاءة التضخيم 0.95 ، فيمكن تصحيح صيغة الحساب △△ C إلى 1.95
حتى الآن ، انتهى المحتوى حول تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري.